石好琪，丁劉慧子，邳 植，吳則東

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引言

糖用甜菜(Beta vulgarisL.)屬于莧科，甜菜屬的一種二年生草本植物[1]，是除甘蔗以外的第二大糖料來源。甜菜利用雜種優(yōu)勢(shì)可以得到更加抗病高產(chǎn)的品種，但要想利用雜種優(yōu)勢(shì)，不育系和保持系的利用是不可缺少的。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是甜菜雜交制種的主要方式。所有雜交甜菜品種的生產(chǎn)都依賴于單一的CMS來源。Owen[2]報(bào)道了甜菜雄性不育是由兩個(gè)隱性核基因（x和z）與不育細(xì)胞質(zhì)相互作用的結(jié)果。具有不育細(xì)胞質(zhì)的甜菜只有在X和Z兩個(gè)位點(diǎn)都攜帶顯性等位基因時(shí)，才被假設(shè)為完全雄性可育。不育系利用保持系植株的花粉進(jìn)行受精繁殖，甜菜保持系細(xì)胞核具有xxzz基因型和正常的可育細(xì)胞質(zhì)。因?yàn)樘鸩耸菬o限花序作物，所以通過人工去雄的方式獲得不育系是不可取的[3]。傳統(tǒng)選育甜菜保持系的方法是利用鑒定法，它是利用已有的不育系與待鑒定的個(gè)體進(jìn)行成對(duì)雜交，該方法的特點(diǎn)是鑒定效率高，比如程大友等[4]利用當(dāng)年抽薹基因型甜菜選育甜菜保持系僅僅用了15個(gè)月左右就鑒定出來了甜菜保持系。盡管傳統(tǒng)方法可以選育出合適的保持系和不育系，但還是耗時(shí)較長(zhǎng)，并且還需要利用當(dāng)年抽薹的甜菜，而且一旦某個(gè)環(huán)節(jié)出錯(cuò)就會(huì)導(dǎo)致選育失敗。通過借助分子標(biāo)記的手段可以快速鑒定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核育性，從而快速確定甜菜是否為不育系或者保持系。鑒定細(xì)胞質(zhì)類型是通過甜菜線粒體基因組中TR1串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)性[5]，保持系的TR1串聯(lián)重復(fù)數(shù)為13，不育系的TR1串聯(lián)重復(fù)數(shù)為4；鑒定細(xì)胞核的育性是通過不同核基因型甜菜DNA的bvORF17上游區(qū)的多態(tài)性[6]。劉一珺[7]在利用分子標(biāo)記對(duì)甜菜育性進(jìn)行鑒定時(shí)所用的甜菜DNA提取方法為CTAB法，但該方法提取效率較低，大規(guī)模提取時(shí)非常耗時(shí)。盡管王良[8]所采用的甜菜DNA提取方法為改良后的CTAB法，但同樣存在步驟繁瑣，效率低的缺點(diǎn)。裂解液法是一種新型的DNA提取方法，采用裂解液法進(jìn)行甜菜DNA提取可以免去使用液氮和各種藥品的麻煩，只需把米粒大小的嫩葉加入裂解液，而后用槍頭進(jìn)行簡(jiǎn)單搗磨，隨后加熱離心即可，這種DNA提取方法簡(jiǎn)單快捷，但所提取的DNA質(zhì)量是否適用于甜菜育性鑒定卻不知。雙重PCR在甜菜[9]、玉米[10]、大豆[11]、水稻[12]等中均已用到。雙重 PCR的利用可以加快相應(yīng)的檢測(cè)速度，但李士龍[13]、劉一珺[7]、劉巧紅等[5]對(duì)甜菜育性進(jìn)行鑒定時(shí)均采用普通PCR，這樣就需要對(duì)同一份DNA進(jìn)行兩次鑒定，相對(duì)雙重PCR更耗時(shí)。劉一珺[7]和王良[8]在對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)類型進(jìn)行鑒定時(shí)采用1%瓊脂糖凝膠電泳，但是聚丙烯酰胺凝膠電泳是否同樣適合作為甜菜育性鑒定的電泳方式卻不知。試驗(yàn)采用裂解液法作為一種新型DNA提取方式與CTAB法進(jìn)行對(duì)比，以便找出更加適合甜菜DNA提取的方法；另外，通過采用雙重PCR的方法對(duì)細(xì)胞質(zhì)類型和細(xì)胞核育性進(jìn)行鑒定，以探究雙重PCR是否能擴(kuò)增成功；最后，對(duì)比1%瓊脂糖凝膠電泳和6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，以找出最佳電泳方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為隨機(jī)抽取的10份糖甜菜嫩葉和5份多胚種質(zhì)資源葉片。

1.1.2 引物 試驗(yàn)所用引物包括鑒定細(xì)胞質(zhì)育性的TR1引物[14]和鑒定細(xì)胞核育性的T1、T2引物[6]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 裂解液、超光速M(fèi)ix、熒光核酸染料、瓊脂糖、1×TAE溶液、10×TBE溶液、TEMED、丙烯酰胺和N',N'-亞甲雙丙烯酰胺混合液。

1.1.4 試驗(yàn)儀器 高速離心機(jī)、PCR儀、凝膠成像儀、金屬浴鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB法和裂解液法提取DNA效果對(duì)比 CTAB法是一種較常用的用于提取甜菜DNA的方法[15]。裂解液法提取甜菜DNA是把甜菜嫩葉放入裂解液搗碎使基因組DNA釋放出來，這種方法提取的DNA混雜程度較高，需要配合相應(yīng)的Mix進(jìn)行后續(xù)的操作。

1.2.2 雙重PCR鑒定甜菜育性 甜菜細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核育性分別用一對(duì)引物進(jìn)行鑒定，因此，要鑒定一株甜菜的育性就需要對(duì)同一DNA模板擴(kuò)增2次然后判斷其育性。采用雙重PCR就可以把2對(duì)引物放入同一體系進(jìn)行擴(kuò)增，提高鑒定效率。因?yàn)殍b定細(xì)胞質(zhì)基因型的引物擴(kuò)增的條帶大小為500 bp或750 bp，鑒定細(xì)胞核基因型育性的引物擴(kuò)增的條帶大小有1300 bp和18000 bp兩種大小的帶型，兩者條帶大小有一定差距不會(huì)影響結(jié)果判斷。另外，兩引物退火溫度大小相同，所以雙重PCR理論上是合適的，具體能否成功需要試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增效果對(duì)比 瓊脂糖凝膠電泳在制膠速度、電泳時(shí)間以及分離范圍上比聚丙烯酰胺凝膠電泳更具優(yōu)勢(shì)，而聚丙烯酰胺凝膠電泳有較高的分辨率，而且一次鑒定的樣品較多。以往鑒定時(shí)均采用瓊脂糖凝膠電泳，不確定聚丙烯酰胺凝膠電泳是否在甜菜育性鑒定時(shí)是否更具優(yōu)勢(shì)，因此試驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增效果對(duì)比，以便在鑒定甜菜育性時(shí)選取合適的電泳方式。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)鑒定用TR1引物，10 μL的PCR擴(kuò)增體系含5 μL超光速M(fèi)ix，0.2 μL的TR1引物，0.6 μL的T1、T2引物，1 μL基因組DNA，3.2 μL的純凈水。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min；94℃變性 25 s，60℃退火 25 s，72℃延伸 2 min，循環(huán) 27次；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.5 電泳

（1）1%瓊脂糖凝膠電泳

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，吸取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，而后在130 V電壓下電泳30 min。電泳后利用凝膠成像儀進(jìn)行條帶觀察。

（2）6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，吸取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，而后在180 V電壓下電泳90 min。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，需要對(duì)膠進(jìn)行染色，采用的方法是核酸染料20 μL+蒸餾水200 mL，充分混均，而后把膠放入其中輕輕搖勻，最后拿到凝膠成像儀進(jìn)行條帶觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTAB法和裂解液法提取DNA結(jié)果對(duì)比分析

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，裂解液法可以通過搗碎后液體的顏色來判斷提取的DNA是否成功。搗碎后液體顏色為嫩綠色（如圖1左）則DNA提取質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求，若是顏色為褐色或棕褐色（如圖1右）則提取失敗，需要重新進(jìn)行提取。

圖1 裂解液法提取的甜菜DNA

試驗(yàn)中用CTAB法提取的甜菜DNA所用材料為隨機(jī)抽取的多胚種質(zhì)資源的葉片。用TR1引物擴(kuò)增的部分結(jié)果如圖2。從結(jié)果中可以看出，CTAB法和裂解液法提的DNA用引物均能有效擴(kuò)增出來?xiàng)l帶。而相較于CTAB法，裂解液法提取的DNA引物擴(kuò)增效果相對(duì)更好，少數(shù)未出來結(jié)果為提取失敗造成，結(jié)果如圖3。

2.2 雙重PCR鑒定細(xì)胞質(zhì)類型和細(xì)胞核育性鑒定結(jié)果分析

隨機(jī)選取10株甜菜DNA嫩葉，采用裂解液法進(jìn)行DNA的提取，而后同時(shí)用TR1引物和T1、T2引物對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖4。從結(jié)果可以看出，除樣品3沒擴(kuò)增出結(jié)果，其余擴(kuò)增的條帶均正常，且不影響同時(shí)判斷2對(duì)引物所擴(kuò)增的條帶。

圖4 甜菜細(xì)胞質(zhì)類型及細(xì)胞核基因型鑒定的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果（裂解液法提取的DNA）

2.3 1%瓊脂糖凝膠電泳和6%聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果分析

采用同樣的DNA提取方式以及PCR體系和程序，用瓊脂糖凝膠電泳跑出來的條帶效果是符合實(shí)驗(yàn)要求的，擴(kuò)增結(jié)果如圖2、3、4等。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用的DNA模板和圖4擴(kuò)增所用的模板相同，擴(kuò)增結(jié)果如圖5。500 bp左右的條帶完全擴(kuò)增出來，并且與其他條帶完全分離，符合實(shí)驗(yàn)要求，而1800 bp、1300 bp左右的條帶卻沒有區(qū)分出來。整體來看，聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增效果不理想，不適合作為甜菜育性鑒定的首選電泳方式。

圖5 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果（裂解液法提取的DNA）

3 討論與結(jié)論

此次試驗(yàn)所采用的裂解液法提取DNA相對(duì)于劉一珺[7]、王良[8]所采用的CTAB法大大節(jié)省了提取時(shí)間，提取100份甜菜DNA只需要1 h，效率上遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于CTAB法，為大規(guī)模用分子標(biāo)記輔助進(jìn)行甜菜育性鑒定奠定了基礎(chǔ)。另外，本次試驗(yàn)所采用的雙重PCR的成功，使得原本需對(duì)一份樣品分別進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)類型和細(xì)胞核基因型鑒定一次就能完成，這不僅較大節(jié)省了鑒定時(shí)間，還節(jié)約了一半的成本。通過對(duì)2種電泳方式進(jìn)行對(duì)比得出，1%瓊脂糖凝膠電泳相對(duì)于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有更大的優(yōu)勢(shì)，因此劉巧紅等[5]、劉一珺[7]、王良[8]所采用的1%瓊脂糖凝膠電泳方式是合適的。

在DNA提取方法上，不同研究者也給出了很多優(yōu)化策略。王茜等[16]采用堿裂解法提取蟲草DNA，使提取一份的時(shí)間縮短到10 min以內(nèi)，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，并且提取的DNA完全滿足實(shí)驗(yàn)需求。劉乃新等[17]同樣采用堿裂解法對(duì)甜菜干種子、幼苗、種仁以及葉片干粉等進(jìn)行DNA的提取，提取的DNA在SSRPCR反應(yīng)中均能擴(kuò)增出清晰的條帶，為快速鑒定甜菜品種純度等提供了技術(shù)支持。郭景倫等[18]利用玉米單粒種子DNA快速提取新方法提取玉米種子DNA，一個(gè)人提取100粒種子只需30 min左右，大大節(jié)省了提取時(shí)間，提取的DNA完全適用于SSR-PCR反應(yīng)。盡管前人在DNA提取中做出了很多優(yōu)化，但所提取的DNA并不一定適用于實(shí)驗(yàn)要求。筆者結(jié)合劉乃新等[17]和王茜等[16]的堿裂解法，采用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl對(duì)甜菜DNA進(jìn)行提取，在用細(xì)胞質(zhì)類型鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)能擴(kuò)增出理想的條帶，但細(xì)胞核育性鑒定引物卻擴(kuò)增不出。因預(yù)計(jì)細(xì)胞核育性鑒定引物最大擴(kuò)增條帶為1800 bp左右，而細(xì)胞質(zhì)類型鑒定引物擴(kuò)增條帶大小最大為750 bp左右，所以筆者做出如下推測(cè)，即對(duì)于較大條帶的擴(kuò)增，堿裂解法提取的DNA質(zhì)量不符合實(shí)驗(yàn)要求。在整個(gè)甜菜育性鑒定體系中，1%瓊脂糖凝膠電泳相對(duì)于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有更大的優(yōu)勢(shì)。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)于2000 bp左右大小的條帶很難跑下來，這也是聚丙烯酰胺凝膠電泳相較于瓊脂糖凝膠電泳弱勢(shì)的地方之一。另外瓊脂糖凝膠電泳制膠過程的便捷性也使其成為甜菜育性鑒定體系的首選電泳方式。分子標(biāo)記輔助鑒定甜菜育性為甜菜育性鑒定帶來了極大的便利，省去了大量的人力物力。

試驗(yàn)中所采用的裂解液法因在提取過程中沒有對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行去除，所以其DNA純度很難保證。在對(duì)于DNA質(zhì)量要求比較高的實(shí)驗(yàn)中，裂解液法所提取的DNA并不能保證適用。另外，因?yàn)樗酓NA純度較低，所以在進(jìn)行PCR時(shí)，應(yīng)適當(dāng)增加程序的延伸時(shí)間以保證產(chǎn)物順利被擴(kuò)增出來。起初，在試驗(yàn)的PCR程序中，把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35次，但擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象，考慮是退火溫度和循環(huán)數(shù)的問題。在經(jīng)過梯度PCR對(duì)退火溫度進(jìn)行排除后，彌散現(xiàn)象仍未解決。在之后試驗(yàn)中對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，得出27個(gè)循環(huán)數(shù)是較為合適的，25個(gè)循環(huán)數(shù)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核鑒定引物擴(kuò)增出的結(jié)果較淡或者擴(kuò)增不出結(jié)果。在甜菜育性鑒定的PCR擴(kuò)增程序中，循環(huán)數(shù)是導(dǎo)致擴(kuò)增條帶有無的決定性因素，這在以往的實(shí)驗(yàn)中是被忽略的。

通過對(duì)10份糖甜菜和5份甜菜多胚種質(zhì)資源嫩葉為試材，采用兩種甜菜DNA提取方法、雙重PCR以及兩種電泳方式對(duì)甜菜育性進(jìn)行鑒定，最終確定用裂解液法進(jìn)行甜菜DNA的提取、雙重PCR進(jìn)行甜菜育性的鑒定、電泳方式選擇用1%瓊脂糖凝膠電泳可以達(dá)到快速鑒定甜菜育性的目的，為利用分子標(biāo)記進(jìn)行甜菜育性鑒定用于以后的育種工作奠定一定基礎(chǔ)。