劉 椒，那立蘋(píng)，張 琳，陳云峰，孫福來(lái)，伍玉鵬①

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.北京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100875；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廢棄物肥料化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；4.濱州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 濱州 256600)

N2O和CO2是導(dǎo)致全球氣候變暖的主要溫室氣體。大氣中每年有5%～20%的CO2和80%～90%的N2O來(lái)源于土壤，其中農(nóng)田土壤每年釋放的N2O和CO2的量可達(dá)3.3和1.4 Tg[1]。如何降低農(nóng)田土壤溫室氣體排放，已成為減緩全球氣候變暖的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

生物炭因其高度穩(wěn)定性和較強(qiáng)的吸附性能，在N2O和CO2等農(nóng)業(yè)溫室氣體減排方面具有較大的應(yīng)用潛力[2]。Meta分析顯示，施用生物炭平均可降低我國(guó)主糧作物農(nóng)田土壤41%的N2O排放，尤其在旱地中施用生物炭效果更為明顯[3]?？萝S進(jìn)等[4]也指出，施用生物炭降低耕地土壤CO2排放量的潛力可高達(dá)41%。也有小部分研究發(fā)現(xiàn)生物炭施用并未顯著影響土壤溫室氣體排放，甚至導(dǎo)致土壤溫室氣體排放增加，但研究者多將這歸咎于生物炭施用量或生物炭性質(zhì)的差異[5]。一般認(rèn)為，生物炭施用量越大，其對(duì)溫室氣體減排效果就越明顯[6]。已有研究表明，生物炭影響土壤溫室氣體排放的機(jī)制包括提高土壤pH 值[7]，增加土壤透氣性[8]和吸附作用[9]，及對(duì)土壤微生物的影響[10]幾個(gè)方面，均主要從土壤物理、化學(xué)和微生物方面開(kāi)展研究，卻很少?gòu)耐寥绖?dòng)物角度進(jìn)行探討。

蚯蚓是最常見(jiàn)的大型土壤動(dòng)物之一，被稱(chēng)為“土壤生態(tài)系統(tǒng)的工程師”，能夠通過(guò)取食、排泄、分泌和掘穴等活動(dòng)直接或間接地參與土壤碳、氮循環(huán)的整個(gè)過(guò)程[11]。Meta分析顯示，蚯蚓能夠增加土壤30%～56%的N2O排放和33%的CO2排放[12]。已有研究認(rèn)為，蚯蚓促進(jìn)N2O和CO2排放的機(jī)制包括蚓糞形成的排放熱點(diǎn)[13]、蚯蚓對(duì)土壤孔隙度的改變[14]、蚯蚓對(duì)土壤有機(jī)物質(zhì)的礦化作用[15]及蚯蚓對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[16]。而蚯蚓生態(tài)類(lèi)型[17]、土壤表層有無(wú)植物殘?bào)w[18]及是否施肥等因素[19]，則是影響蚯蚓作用下土壤溫室氣體排放的重要因素。雖已有研究證實(shí)生物炭施用能夠?qū)ν寥绖?dòng)物的行為特征產(chǎn)生影響[20]，但不同量生物炭施用與蚯蚓作用對(duì)土壤N2O和CO2排放影響的研究卻鮮見(jiàn)。

因此，筆者擬通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)研究不同量生物炭添加與蚯蚓互作條件下土壤N2O和CO2排放變化，并結(jié)合土壤微生物生物量碳(MBC)、溶解性有機(jī)碳(DOC)、無(wú)機(jī)氮和pH等指標(biāo)的變化探討其可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果將有助于從大型土壤動(dòng)物角度進(jìn)一步揭示生物炭施用對(duì)土壤N2O和CO2排放的影響機(jī)制，亦能夠?yàn)樯锾吭谵r(nóng)業(yè)溫室氣體減排上的應(yīng)用提供理論依據(jù)，拓展生物炭施用條件下土壤動(dòng)物介導(dǎo)的土壤碳、氮循環(huán)過(guò)程研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤及蚯蚓同時(shí)采集自湖北省當(dāng)陽(yáng)市半月鎮(zhèn)鳳凰山柑橘試驗(yàn)基地。采樣柑橘園長(zhǎng)期施用商品有機(jī)肥并種植綠肥，土壤中蚯蚓種群密度為36條·m-2，蚯蚓優(yōu)勢(shì)種為Amynthasheterochaetus。取0～20 cm土壤過(guò)5 mm孔徑篩以剔除石塊和植物根茬，將土壤含水率調(diào)整為20.8%(與采樣時(shí)土壤含水率一致)備用。采集鮮土開(kāi)展試驗(yàn)以最大限度保證土壤原始狀態(tài)的化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)。試驗(yàn)開(kāi)始前土壤pH為5.39，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)質(zhì)量含量為26.77 g·kg-1，土壤銨態(tài)氮(NH4+-N)質(zhì)量含量為1.23 mg·kg-1，土壤硝態(tài)氮(NO3--N)質(zhì)量含量為22.36 mg·kg-1。

利用挖掘手撿方法采集土壤中蚯蚓優(yōu)勢(shì)種，挑選性成熟且大小一致的個(gè)體做馴化處理備用，并于試驗(yàn)開(kāi)始前1 d進(jìn)行清腸。

生物炭購(gòu)買(mǎi)自南京智融聯(lián)科技公司。生物炭相關(guān)理化性質(zhì)如下：全碳(TC)質(zhì)量含量為62.18%，全氮(TN)質(zhì)量含量為2.17%，灰分(ASH)質(zhì)量含量為14.5%，pH值為8.8，密度為0.24 g·cm-3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，共設(shè)置僅有土壤(S)、接種蚯蚓(SE)、施用低劑量生物炭(SL)、接種蚯蚓并施用低劑量生物炭(SLE)、施用高劑量生物炭(SH)和接種蚯蚓并施用高劑量生物炭(SHE)6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

在2.5 L玻璃瓶中放入鮮土986 g(折合干土800 g)，隨后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在施用低劑量生物炭處理中充分混勻8.0 g生物炭(土壤干重的1%)，在施用高劑量生物炭處理中充分混勻40.0 g生物炭(土壤干重的5%)，在接種蚯蚓處理中接種蚯蚓2條(折合約60條·m-2)。隨后將玻璃瓶置于室內(nèi)常溫培養(yǎng)50 d。培養(yǎng)過(guò)程中每個(gè)玻璃瓶均用黑色塑料袋進(jìn)行遮光處理，同時(shí)利用橡皮筋將瓶口用帶有小孔(1.5 mm)的塑料薄膜封住，在防止蚯蚓逃逸的同時(shí)也保證能夠與外界有良好的氣體交換。在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)稱(chēng)重法調(diào)節(jié)土壤含水率保持穩(wěn)定。

1.3 取樣與測(cè)定

氣體：培養(yǎng)開(kāi)始前9 d每天采集1次氣體樣品，隨后隔1 d采集1次直至培養(yǎng)結(jié)束。采集氣體時(shí)，先利用風(fēng)扇對(duì)玻璃瓶通風(fēng)10 min以保證瓶子內(nèi)外氣體一致，然后用帶橡膠管的膠塞塞住瓶口，密閉狀態(tài)下培養(yǎng)1 h，利用注射器連接橡膠管，打開(kāi)夾子，抽取瓶中氣體。氣體樣品采集后在當(dāng)天完成測(cè)定，采用氣相色譜儀(GC-7890A，Agilent，USA)分析CO2和N2O濃度。

土壤：培養(yǎng)4、8、15、25、35和50 d時(shí)利用特制小口徑土鉆小心垂直取土壤樣，以盡量避免對(duì)土壤造成過(guò)大的擾動(dòng)而影響氣體排放或?qū)︱球驹斐蓚?。培養(yǎng)35 d時(shí)進(jìn)行破壞性取樣。用蒸餾水浸提土壤DOC后離心，上清液過(guò)0.45 μm孔徑濾膜后用TOC儀(Vario TOC，Elementer，Germany)測(cè)定。土壤NH4+-N和NO3--N含量用KCl溶液浸提后采用靛酚藍(lán)比色法和紫外分光光度法測(cè)定。土壤無(wú)機(jī)氮含量為NH4+-N和NO3--N含量之和。土壤MBC采用氯仿熏蒸法測(cè)定。土壤pH值采用pH計(jì)(PHSJ-4F，雷磁，中國(guó))測(cè)定。

蚯蚓：在培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行破壞性取樣，對(duì)蚯蚓存活情況進(jìn)行計(jì)數(shù)，并在蚯蚓吐泥后用稱(chēng)重法測(cè)定蚯蚓生物量。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

溫室氣體通量計(jì)算公式[21]為

f=ρ×(V/m)×(△c/△t)×(273/T)×β。

(1)

式(1)中，f為氣體排放通量，μg·kg-1·h-1N2O-N或mg·kg-1·h-1CO2-C；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀況下的氣體密度，kg·m-3；V為培養(yǎng)瓶中氣體所占有效體積，m3；△c/△t為特定時(shí)間內(nèi)氣體濃度變化速率，10-6h-1；m為培養(yǎng)瓶中土樣干重，kg；T為絕對(duì)溫度，K；β為由氣體轉(zhuǎn)換為元素C或N時(shí)的轉(zhuǎn)換系數(shù)，N2O和CO2分別為28/44和12/44。

氣體累積排放量通過(guò)內(nèi)插累加法獲得[22]。該方法假設(shè)在2個(gè)已知測(cè)量時(shí)間點(diǎn)之間氣體的排放變化為線性關(guān)系，利用相似三角形原理計(jì)算內(nèi)插點(diǎn)獲得數(shù)據(jù)。

試驗(yàn)結(jié)果以均值表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)CO2和N2O累積排放量等指標(biāo)進(jìn)行方差分析(two-way analysis of variance)，對(duì)蚯蚓因素和生物炭因素進(jìn)行主體間效應(yīng)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓存活率及生物量變化

培養(yǎng)結(jié)束后，所有接種蚯蚓處理瓶中蚯蚓均全部存活，存活率為100%，但蚯蚓生物量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(表1)。與接種前相比，SE處理蚯蚓生物量下降18%，SLE處理蚯蚓生物量下降26%，而SHE處理蚯蚓生物量下降高達(dá)37%。至培養(yǎng)結(jié)束，施加生物炭顯著降低蚯蚓生物量，且隨著生物炭添加量的增加，蚯蚓生物量下降越顯著(P<0.05)。

表1 各處理蚯蚓存活情況

S為僅有土壤，SL為施用低劑量生物炭，SH為施用高劑量生物炭，SE為接種蚯蚓，SLE為接種蚯蚓并施用低劑量生物炭，SHE為接種蚯蚓并施用高劑量生物炭?！啊北硎緹o(wú)數(shù)據(jù)。就相同處理而言，同一行數(shù)據(jù)后英文小寫(xiě)字母不同表示培養(yǎng)前后某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

2.2 蚯蚓與生物炭相互作用對(duì)土壤N2O、CO2排放通量及累積排放量的影響

圖1顯示，試驗(yàn)開(kāi)始后接種蚯蚓處理(SE、SLE和SHE)N2O排放通量快速上升，隨后呈波動(dòng)狀下降并逐漸平穩(wěn)。相對(duì)地，無(wú)蚯蚓接種處理(S、SL和SH)在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中均無(wú)明顯的N2O排放。培養(yǎng)結(jié)束后，接種蚯蚓處理(SE、SLE和SHE)N2O累積排放量分別為589.8、538.0和258.3 μg·kg-1，均顯著高于未接種蚯蚓處理(S、SL和SH 處理N2O累積排放量分別為57.1、34.5和23.4 μg·kg-1)(P<0.05)(圖1)。就無(wú)蚯蚓處理而言，添加生物炭顯著降低N2O累積排放量，但不同添加量之間無(wú)顯著差異。就接種蚯蚓處理而言，添加生物炭顯著降低N2O 累積排放量，且不添加、添加高劑量和添加低劑量生物炭處理之間均存在顯著差異(P<0.05)。

總體來(lái)看，各處理CO2排放通量變化趨勢(shì)與 N2O 排放通量變化趨勢(shì)類(lèi)似，即培養(yǎng)前期CO2排放較高且呈波動(dòng)狀，后期趨于平緩，但接種蚯蚓處理(SE、SLE和SHE)CO2排放通量高于未接種蚯蚓處理(S、SL和SH)(圖1)。培養(yǎng)結(jié)束后，接種蚯蚓處理(SE、SLE和SHE)CO2累積排放量分別為686.1、682.2和420.7 mg·kg-1，均顯著高于未接種蚯蚓處理(S、SL和SH處理CO2累積排放量分別為346.9、268.7和165.9 mg·kg-1)(P<0.05)(圖1)。添加生物炭降低了接種蚯蚓處理CO2累積排放量，但僅高劑量生物炭添加(SHE)與無(wú)生物炭處理(SE)間存在顯著差異(P<0.05)(圖1)。

2.3 蚯蚓與生物炭相互作用下土壤微生物生物量碳及土壤化學(xué)性質(zhì)的變化

雖然接種蚯蚓處理(SE、SLE和SHE)在培養(yǎng)前期表現(xiàn)出更快的MBC上升趨勢(shì)，但整體來(lái)看，各處理之間在MBC變化趨勢(shì)上并無(wú)顯著差異(圖2)。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，未施用生物炭處理(S和SE)DOC含量在大部分時(shí)間均低于其他處理，但各處理之間在DOC含量變化趨勢(shì)上并無(wú)顯著差異(圖2)。

各處理pH均呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，但施加高劑量生物炭處理(SH和SHE)在培養(yǎng)前期pH上升迅速，并從第15天開(kāi)始顯著高于其他處理(圖2)。施加低劑量生物炭處理(SL和SLE)pH高于未施加生物炭處理(S和SE)，但僅在35 d時(shí)觀察到顯著性差異(P<0.05)。同一生物炭施加量條件下，接種蚯蚓與否未對(duì)pH產(chǎn)生明顯影響。

各處理無(wú)機(jī)氮含量在培養(yǎng)初期(0～8 d)均保持較穩(wěn)定，但從8 d后接種蚯蚓處理(SE、SLE和SHE)無(wú)機(jī)氮含量開(kāi)始逐漸上升，而其他處理則仍舊保持穩(wěn)定，甚至下降(圖2)。無(wú)論是否接種蚯蚓，在8 d之后的培養(yǎng)過(guò)程中，與對(duì)應(yīng)的無(wú)生物炭處理相比施加生物炭均降低了土壤無(wú)機(jī)氮含量，且施加量越大，無(wú)機(jī)氮含量下降越多。

對(duì)蚯蚓因素(包含兩個(gè)水平：有/無(wú)蚯蚓)和生物炭因素(包含3個(gè)水平：無(wú)/低/高劑量生物炭)進(jìn)行主體間效應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示蚯蚓對(duì)N2O和CO2累積排放量和土壤無(wú)機(jī)氮含量表現(xiàn)出極顯著作用(P<0.01)(表2)。生物炭施加對(duì)N2O和CO2累積排放量和土壤DOC含量、pH表現(xiàn)出極顯著作用(P<0.01)，對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮含量表現(xiàn)出顯著作用(P<0.05)。而蚯蚓和生物炭施加交互作用下僅對(duì)N2O累積排放量表現(xiàn)出極顯著作用(P<0.01)。

表2 N2O、CO2累積排放量及土壤性質(zhì)的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

3 討論

前人調(diào)查顯示，我國(guó)土壤中蚯蚓密度可高達(dá)277條·m-2，為加快培養(yǎng)試驗(yàn)中的蚯蚓作用過(guò)程，筆者采取接種高于田間實(shí)際蚯蚓密度的方式開(kāi)展試驗(yàn)[23]。此外，筆者研究并未額外為蚯蚓提供食物。因此，食物短缺與蚯蚓個(gè)體之間的競(jìng)爭(zhēng)可能是導(dǎo)致筆者研究中蚯蚓生物量下降的主要原因，這一現(xiàn)象在前人的蚯蚓培養(yǎng)試驗(yàn)中亦有報(bào)道[24]。但施加生物炭處理蚯蚓生物量下降更多且存在明顯的劑量關(guān)系(表1)，這說(shuō)明生物炭可能對(duì)蚯蚓本身產(chǎn)生了不利影響。生物炭是有機(jī)物質(zhì)高溫?zé)峤夂蟮漠a(chǎn)物，其有效養(yǎng)分含量低、穩(wěn)定性高、難分解等特點(diǎn)使其對(duì)蚯蚓適口性較差，進(jìn)而在短期培養(yǎng)中表現(xiàn)出對(duì)蚯蚓的抑制作用[25]。利用2-D培養(yǎng)試驗(yàn)，TOPOLIANTZ 等[26]亦發(fā)現(xiàn)蚯蚓在土壤中通過(guò)吞食創(chuàng)造了14.6 cm3的蚯蚓洞穴，而在混有生物炭的土壤中蚯蚓僅創(chuàng)造了1.7 cm3的蚯蚓洞穴。筆者研究中生物炭與土壤進(jìn)行了充分混合，蚯蚓別無(wú)選擇只能取食包含生物炭的土壤，這對(duì)蚯蚓生物量及活性造成了不可避免的影響[20]。

筆者研究結(jié)果顯示，蚯蚓的存在導(dǎo)致土壤N2O排放提升約10～15倍(圖1)，土壤CO2排放提升約2～3倍(圖1)，這與LUBBERS等[12]的研究結(jié)果一致。雖然蚯蚓自身僅產(chǎn)生很少的N2O，但可通過(guò)促進(jìn)土壤有機(jī)物質(zhì)分解和礦化，增加硝化-反硝化底物來(lái)刺激N2O產(chǎn)生[15]。這一觀點(diǎn)可從圖2中接種蚯蚓處理無(wú)機(jī)氮含量均高于對(duì)應(yīng)的無(wú)蚯蚓處理這一結(jié)果得以證實(shí)。蚯蚓自身呼吸是蚯蚓活動(dòng)增加土壤CO2釋放量的重要部分[27]，其生命活動(dòng)提供的易利用養(yǎng)分亦能通過(guò)刺激微生物活性而促進(jìn)土壤CO2排放。

已有很多研究證實(shí)，由于生物炭普遍呈堿性，且具有多孔結(jié)構(gòu)，因此施用生物炭能夠通過(guò)改善酸性土壤pH值，以及通過(guò)吸附土壤中銨態(tài)氮來(lái)減少硝化作用底物，進(jìn)而抑制土壤N2O排放[28]。筆者研究得到了類(lèi)似結(jié)果，即施用生物炭提高了土壤pH(圖2)，降低了土壤無(wú)機(jī)氮含量(圖2)，降低了土壤N2O排放。就無(wú)蚯蚓處理而言，N2O累積排放量在SL和SH處理間并無(wú)顯著差異，這可能歸結(jié)于低劑量生物炭添加已獲得了較好的土壤無(wú)機(jī)氮吸附效果。蚯蚓與生物炭對(duì)土壤N2O累積排放量的影響存在明顯的交互作用(表2)，且蚯蚓存在時(shí)不同量生物碳施用下的土壤N2O累積排放量均存在顯著差異(圖1)。DRAKE等[29]認(rèn)為，蚯蚓腸道是一個(gè)特殊的微環(huán)境，腸道內(nèi)的厭氧環(huán)境，適宜的pH和濕度，充足的有機(jī)物質(zhì)和硝酸鹽、亞硝酸鹽供應(yīng)等，均能有效促進(jìn)腸道內(nèi)反硝化微生物的生長(zhǎng)。因此，來(lái)源于蚯蚓腸道的微生物隨蚓糞進(jìn)入土壤，并和蚓體分泌的黏液形成有利于反硝化作用的土壤環(huán)境，是導(dǎo)致新鮮蚓糞成為N2O產(chǎn)生熱點(diǎn)的原因[13]。若生物炭混入土壤并被蚯蚓吞食，此時(shí)生物炭的多孔結(jié)構(gòu)就讓生物炭充當(dāng)了一個(gè)氧氣庫(kù)的作用，通過(guò)改變蚯蚓腸道微環(huán)境的氧氣狀況而改變蚯蚓對(duì)土壤N2O排放的影響[30]。當(dāng)混入土壤的生物炭較多時(shí)，被蚯蚓吞食進(jìn)入腸道的生物炭也就更多，對(duì)蚯蚓腸道環(huán)境的作用也就更強(qiáng)。這可能是導(dǎo)致不同劑量生物炭施用對(duì)蚯蚓作用下土壤N2O排放的抑制效應(yīng)產(chǎn)生差異的主要原因。而對(duì)于蚯蚓作用下CO2累積排放量來(lái)說(shuō)，則主要集中在蚯蚓自身活性的改變上，因此僅在高劑量生物炭施用與無(wú)生物炭施用之間存在顯著差異。

作為“土壤生態(tài)系統(tǒng)的工程師”，蚯蚓在土壤中既扮演有利的角色，如促進(jìn)土壤形成、促進(jìn)作物生長(zhǎng)等，也有不利的一面，如增加土壤N2O和CO2排放。筆者研究發(fā)現(xiàn)，施加生物炭可抑制蚯蚓誘導(dǎo)的土壤溫室氣體排放，但與此同時(shí)對(duì)蚯蚓本身不利的影響也削弱了蚯蚓的生態(tài)系統(tǒng)功能。若要達(dá)到兩者的平衡，或許可以從生物炭施用量上入手，如在低劑量添加條件下即可顯著降低蚯蚓存在時(shí)的N2O排放(圖1)。此外，生物炭本身的性質(zhì)，如元素組成、孔隙結(jié)構(gòu)特征等，亦是影響其溫室氣體減排效果的關(guān)鍵因子[31]。未來(lái)可以考慮采用不同類(lèi)型生物炭開(kāi)展更多研究，以進(jìn)一步明確生物炭-蚯蚓互作對(duì)土壤溫室氣體排放的影響。

4 結(jié)論

(1)無(wú)論是否添加生物炭，與無(wú)蚯蚓處理相比，接種蚯蚓(Amynthasheterochaetus)均顯著促進(jìn)土壤N2O和CO2的排放。

(2)施用生物炭顯著降低了蚯蚓誘導(dǎo)的土壤N2O 排放量，且施用量越大，效果越明顯。

(3)僅施用高劑量生物炭能顯著降低蚯蚓誘導(dǎo)的土壤CO2排放量。