程 麗，陳 雯，趙成波，王潤(rùn)秀，謝富華

（1.贛南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 贛州 341000）

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是我國(guó)最常見(jiàn)原發(fā)性腎小球疾病，也是我國(guó)導(dǎo)致終末期腎臟?。‥nd-Stage Renal Disease，ESRD）的 重 要 病 因 之一［1］。IgAN 的發(fā)病在歐洲和亞洲占原發(fā)性腎小球疾病的15%～40%。按病理變化，目前可分為5 型：系膜細(xì)胞增生型、內(nèi)皮細(xì)胞增生型、節(jié)段性硬化或粘連型、腎小管萎縮或腎間質(zhì)纖維化型和細(xì)胞纖維性新月體型。然而，該病自首次報(bào)道以來(lái)，半個(gè)多世紀(jì)過(guò)去了，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［2］。不過(guò)，腎病研究者們普遍認(rèn)為β1，3-半乳糖苷酶糖（C1GALT1）活性下降導(dǎo)致糖基化水平下降的IgA1（Under glycosylation IgA1，Ug-IgA1）的形成是IgAN發(fā)病的關(guān)鍵所在［3-4］。那么，是什么原因?qū)е娄?，3-半乳糖苷酶糖（C1GALT1）活性下降？研究表明C1GALT1 基因未發(fā)現(xiàn)有突變和高度甲基化現(xiàn)象，但其伴侶蛋白C1GALT1C1表達(dá)下調(diào)可能對(duì)IgAN 發(fā)病起了關(guān)鍵作用。

miRNA 是一類長(zhǎng)度為22～25 nt 的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它們能夠與靶基因mRNA 分子3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）不完全性地互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，廣泛參與到胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過(guò)程。近來(lái)，有研究表明IgAN患者外周血或尿液中存在許多差異表達(dá)的miRNA，這對(duì)于疾病的診斷和預(yù)后判斷具有一定的意義。因此，本研究采用miRNA表達(dá)譜測(cè)序探討導(dǎo)致C1GALT1C1 表達(dá)下調(diào)的可能因素，并對(duì)C1GALT1C1 是否參與IgAN 發(fā)病進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、外周血樣本及siC1GALT1C1 慢病毒載體人B淋巴細(xì)胞株DAKIKI（購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；IgAN 患者和健康成人（Healthy control，HC）EDTA 外周抗凝血來(lái)自贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；siC1GALT1C1 及陰性對(duì)照慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因。

1.2 主要儀器與試劑RPMI-1640 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清和RNA 提取試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；人外周淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。SYBR Green Ⅰ和cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；二奎琳甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；Ug-IgA1 ELISA 試劑盒購(gòu)自日本IBL 生物有限公司；anti-C1GALT1C1 和anti-ACTIN 購(gòu) 自 美 國(guó)Cell Signaling Technology公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories，Inc.。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)DAKIKI 細(xì)胞株購(gòu)自北納生物科技有限公司，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10% FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、正常濕度，5%二氧化碳孵箱，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)，離心按1∶3 傳代。實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.2 外周血單核淋巴細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取與Western blot 檢測(cè)經(jīng)分離得到的外周血單核淋巴細(xì)胞采用放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)裂解液（Radio immunoprecipitation assay，RIPA）法提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度；蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育抗體過(guò)夜，洗膜后孵育二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（Enhanced chemiluminescence，ECL）顯色曝光。

1.3.3 siC1GALT1C1 慢病毒載體感染效率與基因沉默效率檢測(cè)接種DAKIKI細(xì)胞于6孔板；24 h后給予病毒（MOI=10，下文均采用該值感染細(xì)胞）；病毒感染后72 h 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并收集細(xì)胞采用1.3.2 中所述方法行Western blot 檢測(cè)C1GALT1C1和ACTIN蛋白。

1.3.4 ELISA 檢 測(cè)DAKIKI 細(xì) 胞Ug-IgA1 水 平DAKIKI 細(xì)胞接種于12 孔板，24 h 后按MOI=10 的量給予病毒感染細(xì)胞，以攜帶siNC 慢病毒載體為陰性對(duì)照，以PBS 為空白對(duì)照，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。病毒感染后72 h 收集細(xì)胞上清，3 000 rpm 離心5 min，取上清置于冰上，立即按IBL公司的Ug-IgA1 ELISA 檢測(cè)試劑盒操作。

1.3.5 外周血單核淋巴細(xì)胞的提取與miRNA 表達(dá)譜測(cè)序及其結(jié)果分析收集入住我院經(jīng)腎活檢確診為IgAN 患者以及健康成人的外周靜脈EDTA抗凝血約9 mL，按照人外周淋巴細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明分離獲取外周血單核淋巴細(xì)胞，液氮速凍后干冰寄送至深圳華大基因科技有限公司行miRNA 表達(dá)譜測(cè)序。獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，選擇差異表達(dá)2倍以上的miRNA 應(yīng) 用pictar、targetscan、miRanda 和miRBase軟件行miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，將至少出現(xiàn)在3 個(gè)軟件中的基因作為可能的靶基因；對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO 功能聚類和KEGG Pathway 功能分析；篩選一批以C1GALT1C1為靶基因的miRNAs。

1.3.6 外周血單核淋巴細(xì)胞總RNA 提取與miRNA 表達(dá)驗(yàn)證采用Trizol 提取細(xì)胞總RNA，取100～200 ng 細(xì)胞總RNA，按PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒（TaKaRa）說(shuō)明進(jìn)行miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（采用莖環(huán)引物法）；取適量cDNA，使用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒（TakaRa）和特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，以U6為內(nèi)對(duì)參，以SYBR Green Ⅰ為染料采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，最終結(jié)果取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為減小觀察誤差，采用3次測(cè)量取平均值作為最終觀測(cè)值的方法。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法比較三組指標(biāo)均數(shù)，并用SNK法進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 IgAN 外周血單核淋巴細(xì)胞C1GALT1C1 蛋白表達(dá)下調(diào)我們收集了11 例經(jīng)腎活檢確診為IgAN 的患者［Lees分級(jí)Ⅲ級(jí)3例，Ⅳ級(jí)3例，未分級(jí)5例；年齡（37.4±11.8）歲，P＞0.05］和6 例HC 的外周抗凝血樣本，分離外周血單核淋巴細(xì)胞后RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，取部分樣本進(jìn)行Western blot檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于HC，IgAN 患者的C1GALT1C1蛋白的平均水平下調(diào)約40%（P＜0.05，如圖1所示）。

2.2 慢病毒介導(dǎo)DAKIKI 細(xì)胞C1GALT1C1 基因表達(dá)下調(diào)病毒感染DAKIKI 細(xì)胞后72 h，幾乎所有細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光蛋白（如圖2A所示），表明慢病毒成功介導(dǎo)siC1GALT1C1表達(dá)載體進(jìn)入該細(xì)胞并被表達(dá)；進(jìn)一步通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siC1GALT1C1組C1GALT1C1 蛋白相對(duì)于siNC 組下調(diào)約20%（P=0.0292，F(xiàn)=6.746；如圖2B所示）。

圖1 外周血單核淋巴細(xì)胞C1GALT1C1蛋白水平

2.3 C1GALT1C1 基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致DAKIKI 細(xì)胞產(chǎn)生Ug-IgA1慢病毒感染分泌IgA1 細(xì)胞系DAKIKI 后72 h，siC1GALT1C1 組相對(duì)于siNC 組，其細(xì)胞培養(yǎng)上清中糖基化水平低下的IgA1 水平升高（P=0.0046，F(xiàn)=15.01；圖3所示）。

圖2 慢病毒感染效率及基因沉默效果檢測(cè)

圖3 siC1GALT1C1 對(duì)DAKIKI細(xì)胞產(chǎn)生Ug-IgA1的影響

2.4 IgAN 外周血單核淋巴細(xì)胞靶向C1GALT1C1基因的miRNA 表達(dá)譜改變IgAN 外周血單核淋巴細(xì)胞中相對(duì)于HC，共有1 218 個(gè)miRNA 有差異表達(dá)，其中有123個(gè)miRNA 差異表達(dá)在2倍以上（圖4A所示），選取高表達(dá)排在前10%的miRNA 表達(dá)驗(yàn)證，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果基本與測(cè)序結(jié)果一致。對(duì)這123個(gè)miRNA 的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行KEGG 聚類分析發(fā)現(xiàn)它們主要聚集于IL17、Cytokine-cytokine receptor 和Kemokine 等細(xì)胞因子信號(hào)通路（圖4B 所示，紅色箭頭標(biāo)記）；并從中篩選出25 個(gè)以C1GALT1C1 為靶基因的miRNA（圖4C所示）。

圖4 IgAN miRNA表達(dá)譜分析及靶向C1GALT1C1基因的miRNAs篩選

3 討 論

IgAN 是一種腎小球系膜區(qū)以IgA 或IgA 免疫復(fù)合物沉積為主的原發(fā)性腎小球疾病。它的流行在不同洲、不同國(guó)家或在一個(gè)國(guó)家不同地區(qū)的分布差異很大，如亞太地區(qū)（中國(guó)、日本和新加坡等）、歐洲、北美洲國(guó)家該病的發(fā)病率分別占原發(fā)性腎小球疾病的40%～50%、20%、8%～12%［5］。IgAN 是我國(guó)最常見(jiàn)原發(fā)性腎小球疾病，是終末期腎臟病的重要病因之一。然而，遺憾的是IgAN的確切發(fā)病機(jī)理至今仍未完全闡明，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多，目前認(rèn)為其發(fā)病的原因可能是由于患者體內(nèi)C1GALT1 的活性下降使血循環(huán)中IgA1 鉸鏈區(qū)糖基化水平低下，進(jìn)而導(dǎo)致這種缺陷型IgA1 及其免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積進(jìn)而誘發(fā)炎癥［3-4，6］。近來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)C1GALT1 的分子伴侶C1GALT1C1在IgAN 患者中表達(dá)下調(diào)，但C1GALT1C1 對(duì)于該病的發(fā)病是否具有關(guān)鍵作用以及是什么原因?qū)е缕浔磉_(dá)下調(diào)等問(wèn)題仍有待進(jìn)一步闡明。

目前，關(guān)于miRNA 和IgAN 的研究較少，近來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IgAN 患者腎臟組織和尿液中存在較多差異表達(dá)的miRNA［7-12］。還有學(xué)者從IgAN患者外周血單核細(xì)胞中篩選出一種可能靶向C1GALT1 的miR-148［8］，但是他們并未提及靶向C1GALT1C1 的miRNA。

為了證實(shí)伴侶蛋白C1GALT1C1 是否參與了IgAN的發(fā)病，我們收集了11例IgAN外周血樣本，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者C1GALT1C1蛋白平均水平下降，這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。然后通過(guò)慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)在一種能持續(xù)分泌IgA1 細(xì)胞系DAKIKI［13-14］中發(fā)生C1GALT1C1 RNAi，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)C1GALT1C1 基因被部分沉默時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)糖基化低下的IgA1（Ug-IgA1）水平升高，而Ug-IgA1 的產(chǎn)生以及持續(xù)存在于血循環(huán)中被認(rèn)為可能是IgAN發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，我們認(rèn)為伴侶蛋白C1GALT1C1表達(dá)下降可能對(duì)IgAN 發(fā)病起了關(guān)鍵作用。為了尋找導(dǎo)致C1GALT1C1蛋白表達(dá)下降的原因，我們進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有1 218個(gè)miRNA 有差異表達(dá)，其中有123 個(gè)miRNA 差異表達(dá)在2 倍以上，對(duì)這123 個(gè)miRNA 的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行KEGG 聚類分析發(fā)現(xiàn)它們主要聚集于IL17、Cytokine-cytokine receptor 和Kemokine 等細(xì)胞因子信號(hào)通路，這提示炎癥在IgAN發(fā)病中也起了重要的作用。同時(shí)，我們篩選到25 個(gè)靶向C1GALT1C1 基因的miRNA，這對(duì)該病的診斷和預(yù)后可能具有較為重要的指導(dǎo)作用。