肖劍波，鐘佳寧，陳 斌

（1.贛南醫(yī)學院2018級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室；3.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科，江西 贛州 341000）

腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）最早由IOANNIDES 和WHITESIDE［1］提出，在腫瘤血管生成起著關鍵作用，而腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關鍵環(huán)節(jié)。TME 主要由腫瘤細胞、細胞外基質(zhì)蛋白（Extracellular matrix，ECM）、血管、成纖維細胞、免疫細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞（Endothelial cells，ECs）、神經(jīng)和細胞因子組成［2］。有文獻報道在沒有腫瘤血管生成的情況下，腫瘤生長直徑不會超過2 mm［3］。雖然一代和二代抗腫瘤血管靶向藥物已投入臨床應用，然而我們發(fā)現(xiàn)單獨阻斷血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）對某些癌癥患者沒有明顯的益處。這給我們啟示，腫瘤血管生成不是簡單的分子信號通路串聯(lián)總和，可能是多通路廣泛聯(lián)系、相互影響的生物事件綜合效應。隨著研究進展，我們越來越關注將腫瘤作為一個生態(tài)環(huán)境來探討包括腫瘤血管生成在內(nèi)的生物事件。

1 腫瘤微環(huán)境特點

在各種致癌誘因下，腫瘤細胞獲得持續(xù)增殖和抗凋亡的能力并不斷生長，腫瘤快速生長而血管生成滯后及血管功能異常，常導致腫瘤缺氧。缺氧是公認的TME 特點，在低氧環(huán)境下作為廣譜轉(zhuǎn)錄因子HIFα 在胞質(zhì)穩(wěn)定性增加，最終轉(zhuǎn)運至胞核與HIFβ結合，增加包括促血管生成因子在內(nèi)的眾多靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達［4］。這些靶基因的表達改變了腫瘤代謝方式與分泌譜，其中最為經(jīng)典的是有氧糖酵解，使TME 呈低氧、酸性、高滲特點；TME 中基因譜表達的改變產(chǎn)生了不同于正常組織的趨化因子，招募大量骨髓和鄰近組織來源的干細胞及免疫細胞并對其進行選擇性分化，加重腫瘤炎性改變和免疫耐受。上述過程導致血管生成抑制因子下調(diào)，促血管生成因子表達增加，打開血管生成“開關”，啟動血管生成。不斷演進的TME 反過來又對各種細胞產(chǎn)生深遠的影響，包括遺傳改變和表觀修飾及分子表達調(diào)節(jié)，形成更加有利于腫瘤進展的炎性、免疫耐受和藥物屏障等局部環(huán)境，在所有腫瘤成員細胞的“努力”下，腫瘤血管快速畸形生成。然而，低氧和酸性等“惡劣”環(huán)境也對腫瘤細胞有害，從而對腫瘤細胞進行“優(yōu)勢選擇”，經(jīng)過選擇的腫瘤細胞更具惡性表型，使腫瘤侵襲力和轉(zhuǎn)移風險進一步增加。

2 癌細胞刺激血管生成

癌細胞在TME 處于核心地位，是腫瘤缺氧的始動者，直接或間接參與腫瘤血管生成。在缺氧條件下，缺氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor，HIF）直接上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）［5］、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR1/2）［6］、血管生成素（Angiopoietin-1/2，Ang1/2）［7］，血小板源性生長因子-B（PDGF-B）［8］，血管生成素受體（Tie-2）［9］以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）［10］等促血管生成因子基因表達。MARJON PL 等［11］在培養(yǎng)細胞時觀察到，當周圍環(huán)境的氧水平從21%降低到0.3%時，VEGF mRNA 水平增加了約10至50倍。在人多形性膠質(zhì)母細胞瘤中，壞死和缺乏血管的焦化區(qū)VEGF mRNA 表達最高。癌細胞間接誘導血管生成主要通過對招募細胞進行極化形成腫瘤相關間質(zhì)細胞，促進促血管生成因子的表達。當然，除了缺氧，某些癌基因、抑癌基因也會直接影響HIF 的表達或者活性調(diào)控，例如：野生型P53蛋白參與抑制HIF-1 的活性調(diào)節(jié)而P53 基因突變或缺失導致HIF-1增加［12］；抑癌基因PTEN 失活會通過PI3K/Akt途徑增加HIF穩(wěn)定性，而PTEN的恢復又會抑制HIF 的表達［13］。HIF 的表達或穩(wěn)定性增加，HIF依賴的促血管生成因子表達也增加，作為VEGF 的受體，VEGFR 除了在血管內(nèi)皮表達，也在間質(zhì)細胞及腫瘤細胞表達，從而形成了更加復雜的血管生成調(diào)控網(wǎng)絡。VEGF/VEGFR 結合使受體二聚化，從而激活受體和下游PI3K-Akt、PLC-ERK 等信號級聯(lián)［14］。實驗表明，VEGFR-1 阻斷抗體可阻止人臍血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）對VEGF-A 遷移但不影響其增殖，提示VEGFR-1 主要參與了內(nèi)皮細胞遷移［15］，VEGFR-1 還參與單核-巨噬細胞和造血干細胞招募，與TME的重建相關。VEGR2是一個高親和力受體，是參與腫瘤相關血管有絲分裂、趨化和血管通透性作用的主要受體。有實驗報道VEGF-A 激活VEGFR-2導致整合素的PI3K/Akt依賴性激活，導致細胞粘附和遷移增強，這種與整合素的協(xié)同作用是VEGFR-2產(chǎn)生信號所必需的［16］。

3 間質(zhì)細胞參與腫瘤血管生成

腫瘤相關成纖維細胞（Cancer-associated fibro?blasts，CAFs）是最豐富的腫瘤間質(zhì)細胞，OLUMI 等首次證明腫瘤相關成纖維細胞促進前列腺癌生長［17］，后來相繼在乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤證明與腫瘤進展和血管生成相關。成纖維細胞除了直接產(chǎn)生VEGF外，更重要的是分泌基質(zhì)細胞衍生因子1（SDF-1/CXCL12），CXCL12 通過腫瘤細胞CXCR4 受體刺激腫瘤細胞的生長，并將內(nèi)皮祖細胞募集到TME［18］和直接趨化血管內(nèi)皮細胞［19］，促進血管生成。此外CXCL12 能誘導內(nèi)皮細胞表達VEGF-A 通過自分泌促進血管生成［20］。腫瘤相關的免疫細胞是腫瘤微環(huán)境最復雜的間質(zhì)細胞群，引起腫瘤微環(huán)境呈慢性炎性和免疫耐受特點，對腫瘤血管生成等腫瘤進展的關鍵環(huán)節(jié)具有重大貢獻。實驗表明腫瘤相關巨噬細胞（TEMs）與腫瘤血管生成密切相關［21］，且TEMs 功能缺失抑制血管生成和腫瘤生長［22］。在腫瘤進展過程中，TMEs 產(chǎn)生TFGβ、TNFα、IL-1α、花生四烯酸等細胞因子，誘導腫瘤細胞表達IL-8 和VEGF-A，誘導血管生成［23］。近年來發(fā)現(xiàn)肥大細胞在腫瘤血管生成也起著重大作用，肥大細胞c-Kit受體激活后分泌類胰蛋白酶激活PAR-2 受體，啟動非經(jīng)典促血管生成途徑［24］。在粘液纖維肉瘤患者中，中性粒細胞數(shù)量增加與腫瘤微血管密度（MVD）增加相關［25］，研究發(fā)現(xiàn)在ras癌基因驅(qū)動的腫瘤進展模型中，腫瘤相關的中性粒細胞（TANs）介導IL-8等炎性介質(zhì)表達誘導血管生成［26］，此外中性粒細胞還通過分泌MMPs 等蛋白酶或調(diào)節(jié)其活性誘導血管生成［23］。目前對骨髓來源內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells ，EPCs）在腫瘤相關血管生成的作用存在爭議，有研究顯示EPCs在腫瘤組織內(nèi)血管形成的參與程度高于一般肉芽組織。有文獻報道EPCs可以占腫瘤脈管系統(tǒng)的50%～100%［27-28］，而另一些文獻表明腫瘤血管內(nèi)皮很少檢測到EPCs［29-30］，另外，有文獻指出，EPCs以25%～30%直接參與腫瘤早期血管生成，而4 周后EPCs 的比例降至1%［31］。在淋巴瘤和神經(jīng)母細胞瘤中，觀察到內(nèi)皮細胞部分來源于惡性細胞［32-33］。WANG R［34］和RICCI-VITIANI L［35］等用惡性膠質(zhì)瘤干細胞在體外轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細胞并在體內(nèi)證明其與血管生成有關。而CHENG L等的實驗證明惡性膠質(zhì)瘤干細胞只能轉(zhuǎn)化為血管周細胞，而不能轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細胞［36］。血管周細胞對內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、血管形成和通透性都有關鍵影響，血管周細胞分泌VEGF 促進內(nèi)皮細胞增生［37］，血管周細胞和平滑肌細胞均可表達Ang1和Ang2。Ang1/Tie2 介導內(nèi)皮細胞存活和成熟信號，Ang2/Tie2介導內(nèi)皮細胞不穩(wěn)定，從而促進毛細血管出芽，形成新的血管［38］。

4 腫瘤酸性環(huán)境在腫瘤血管生成的作用

有報道指出酸性環(huán)境誘導骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細胞凋亡，抑制血管生成［39］，酸性環(huán)境通過G蛋白偶聯(lián)受體-4（GPR4）激活人血管內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急通路，增加內(nèi)皮細胞的死亡［40］。然而有文獻報道乳酸可以通過單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-1（MCT1）受體進入內(nèi)皮細胞，通過KB/IL-8 通路促進腫瘤血管生成［41］，內(nèi)皮細胞中乳酸在常氧條件下也能促進血管生成［42］。有趣的是，乳酸誘導的VEGF 表達需要酸性pH，然而僅酸性pH 不能穩(wěn)定HIF-1α，腫瘤表達VEGF 減弱［41］。胞外酸性環(huán)境更多是通過癌細胞、間質(zhì)細胞和基質(zhì)理化性質(zhì)的改變間接促進血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)胞外低pH 通過胞外信號激酶、P38絲裂原活化蛋白激酶、NF-κB 信號通路激活間充質(zhì)干細胞，分泌促血管生成物CXCL8［43］。酸性細胞外環(huán)境也通過ERK1/2 MAPK 信號通路誘導人膠質(zhì)母細胞瘤細胞VEGF 表達［44］。酸性環(huán)境還能夠誘導腫瘤細胞或間質(zhì)細胞MMP9、PDGF、VEGF、IL-8 等促血管生成基因的表達。此外，酸性環(huán)境能夠增加MMP9/2等蛋白酶活性，從而促進血管生成。

5 神經(jīng)系統(tǒng)對腫瘤血管生成的作用

神經(jīng)在腫瘤中的作用一直被忽視，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)在腫瘤血管生成方面具有不可或缺的作用。神經(jīng)系統(tǒng)與前列腺癌［45］、胃癌［46］、胰腺癌［47］、乳腺癌［48］、卵巢癌［49］等相關。有研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷患者前列腺癌發(fā)病率較低［50］。FAULKNER S 等研究表明，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與TME中神經(jīng)密度相關［51］。ZAHALKA一項研究表明，腫瘤交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素通過血管內(nèi)皮受體促進腫瘤血管生成［45］，這與之前報道交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活可以刺激癌癥的發(fā)展吻合［52］。有研究表明，β受體阻滯劑對黑色素瘤［53］、非小細胞肺癌［54］、乳腺癌［55］、卵巢癌［56］及多發(fā)性骨髓瘤［57］進展有積極影響。一個簡單事實：癌癥相關的疼痛能為大腦皮層所感受，表明腫瘤微環(huán)境與大腦皮層相關。有文獻報道壓力［58］和社會條件［59］可以促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移，壓力可能通過腫瘤微環(huán)境內(nèi)交感神經(jīng)的激活直接刺激血管生成［45］。應激釋放的兒茶酚胺可激活卵巢癌細胞上腎上腺素β2受體（ADRB2），使VEGF基因表達增加，使腫瘤血管化增強［60］，也有報道社會壓力通過腫瘤細胞β 受體上調(diào)炎性基因的表達［61］，從而促進腫瘤血管生成。此外，神經(jīng)系統(tǒng)與腫瘤間質(zhì)細胞尤其是免疫細胞關系密切，在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移起重要作用［62-63］。

6 外泌體/囊泡對腫瘤血管生成的作用

外泌體來源于細胞的脂質(zhì)雙層膜泡，大小約30～100 nm［64］，內(nèi)含各種非編碼RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)［65］，主要攜帶親代細胞的各種生物信息，并在受體細胞中誘導多種信號反應。外泌體在多種腫瘤TME 中分泌增加并廣泛參與腫瘤血管生成，乳腺癌細胞的胞外囊泡攜帶的VEGF 激活內(nèi)皮細胞VEGFR促進腫瘤血管生成［66］，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的外泌體富含Dll-4，抑制內(nèi)皮細胞內(nèi)Notch 信號傳導，增加腫瘤血管密度［67］，在結直腸癌中，腫瘤來源外泌體囊泡中miR-9 通過抑制內(nèi)皮細胞SOCS5 的表達，促進內(nèi)皮細胞的遷移和血管生成作用［64］。外泌體也是腫瘤酸性環(huán)境的主要貢獻者［68］，而低氧和酸性環(huán)境反過來又誘導外泌體分泌增加，且酸性環(huán)境增加受體細胞融合外泌體的能力，有利于腫瘤血管生成效能［69-70］。實驗表明，缺氧誘導癌細胞富含miR210的外泌體分泌，轉(zhuǎn)運至內(nèi)皮細胞，抑制Ephrin A3和PTP1B的表達，促進腫瘤血管生成［71］。來源于缺氧肺癌外泌體的miR23a，轉(zhuǎn)運至內(nèi)皮細胞抑制PHD1/PHD2和ZO-1，導致HIF 在胞內(nèi)穩(wěn)定性增加，增加腫瘤血管生成和血管通透性［72］。事實上從缺氧腫瘤細胞分離出的囊泡在體內(nèi)外促進血管生成和腫瘤生長的作用比常氧情況下更強［72］。也有報道證明間充質(zhì)干細胞外泌體的miRNA 對血管生成起著廣泛作用［73］，癌細胞來源的外泌體還可作用于間質(zhì)細胞間接促進腫瘤相關血管生成。有文獻報道黑色素瘤細胞分泌的外泌體miR155-5p作用于腫瘤相關的成纖維細胞，靶向抑制SOCS1，從而下調(diào)JAK2/STAT3信號通路和增加VEGFα、FGF2、MMP9 等促血管生成因子的表達［74］。施曉雷等研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞來源的外泌體miR-21轉(zhuǎn)入造血干細胞，下調(diào)其靶蛋白PTEN 而激活PDK1/Akt 信號通路，將造血干細胞轉(zhuǎn)化為CAFs，促血管生成因子IL-6 和IL-8 分泌而增加，加速腫瘤進展［75］。當然，腫瘤相關的成纖維細胞外泌體也能反作用影響腫瘤細胞［76-77］，在這里不再概述，但不得不強調(diào)，腫瘤相關成纖維細胞的外泌體參與腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［78］，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換后的腫瘤細胞分泌的外泌體更具有促進腫瘤血管生成的能力［79］。目前尚未見文獻報道腫瘤相關的免疫細胞外泌體直接參與血管內(nèi)皮調(diào)節(jié)，但我們觀察到腫瘤來源的外泌體可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的M2/PD1+極化［80-81］，極化的巨噬細胞能促進血管生成。腫瘤分泌的miR-21和miR-29a在腫瘤免疫細胞中作為配體直接與toll 樣受體（TLR）家族的受體結合，從而觸發(fā)TLR 介導的炎癥反應［82］，而腫瘤的炎癥環(huán)境有利于腫瘤血管生成。目前關于內(nèi)皮細胞的外泌體通過旁分泌或自分泌促進血管的生成尚未見報道。

7 結論與展望

腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等多種過程離不開腫瘤血管生成，而腫瘤血管生成是TME 中所有細胞共同作用的結果。盡管TME 對腫瘤血管生成的的研究取得了不少的成果，但就目前而言，更加深入的信號關聯(lián)及作用機制并把這些策略轉(zhuǎn)化為臨床實踐還是一個巨大的挑戰(zhàn)。未來，我們在TME 對腫瘤血管生成的研究重點依然在TME 的網(wǎng)絡信號調(diào)節(jié)，關鍵在炎性和免疫方向，從而對TME 中細胞和分子在治療血管生成的作用進行精確評估，為抗腫瘤血管靶向治療提供精準方案。