賴郅昊，何智霖，譚佳偉，陳治希，李林福，施偉梅，吳龍火

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2020級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

九里香（Murraya exotica L）為蕓香科九里香屬植物，氣香，味苦、辛，其葉、根、皮和果實(shí)均可入藥，有行氣止痛、活血散瘀等功效［1-2］。研究表明，九里香具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌抗氧化等藥理作用，這可能與其富含黃酮類化合物有關(guān)［3-4］。九里香酮（5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮，5，7，3’，4’-Tetramathoxyfla?vone，TMF）是九里香葉中黃酮類的一種主要化合物，可顯著下調(diào)軟骨細(xì)胞中NO 的水平，下調(diào)NO 誘導(dǎo)的Bim表達(dá)，保護(hù)軟骨細(xì)胞，但具體作用機(jī)制尚不完全清楚［5-6］。也有研究認(rèn)為九里香酮的保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用并非九里香酮直接作用，而是九里香酮的代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用［7-9］。因此，研究九里香酮化合物的體內(nèi)代謝對進(jìn)一步闡明九里香及其黃酮類化合物抗骨關(guān)節(jié)炎藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重大意義。

代謝組學(xué)是以生物體液為研究對象，運(yùn)用系統(tǒng)的研究手段考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物的變化，從而反映生物體體內(nèi)的生物學(xué)過程變化情況［10-11］。與疾病相關(guān)的代謝組學(xué)方法與應(yīng)用研究是目前代謝組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［12-14］，廣泛應(yīng)用于病變標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷。

目前，其主要的研究平臺有核磁共振（NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）。液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）是由超高分離度、超快速分離的超高效液相（UPLC）與高靈敏度、高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）結(jié)合而成的UPLC-MS 技術(shù)，能直接分析體液及組織提取物而無須衍生化操作，并可獲得化合物的準(zhǔn)確分子量及豐富的結(jié)構(gòu)信息，已發(fā)展成為代謝組學(xué)研究的主流技術(shù)手段［15-16］。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相-四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）對九里香酮（TMF）在小鼠尿液中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。探索TMF 在小鼠體內(nèi)的代謝模式及TMF的作用途徑，為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和代謝機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料超高效液質(zhì)聯(lián)用儀Xevo G2-XS QTof［沃特世科技（上海）有限公司］；超純水機(jī)ED115（美國賽默飛世爾科技公司）。

香葉木素分析對照品（純度＞98%，北京索萊寶科技有限公司）；3，4，5，7-四甲氧基黃酮（純度＞98%，北京索萊寶科技有限公司）；乙腈（HPLC 級，美國Fisher 公司），去離子水（自制）；采血管（3.8%枸櫞酸鈉1∶4，河北鑫樂科技有限公司）。

健康SPF 級KM 小鼠，8 周齡，體重（40±5）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TMF溶液的配制精密稱取50.0 mg TMF，置10 mL 容量瓶中，加入PBS 緩沖溶液，使其溶解并定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的TMF貯備液，于4 ℃冰箱保存；小鼠給藥劑量：50 mg·kg-1。

1.2.2 生物樣品的收集與處理將6 只小鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組3只（雄性），分組后即放入代謝籠中進(jìn)行飼養(yǎng)，適應(yīng)喂養(yǎng)7 d 后，提前12 h 禁食不禁水，基于前期抗骨關(guān)節(jié)炎藥效研究結(jié)果，按劑量50 mg·kg-1灌胃給藥［7］，空白組給同樣體積的生理鹽水，收集24 h 內(nèi)的尿液，即時(shí)收集，于－20 ℃內(nèi)保存，備用。

同組小鼠尿液等量合并，移取尿樣200 μL，加入20 μL 1 mol·L-1的鹽酸，旋渦30 s，加80%甲醇至2 mL，超聲15 min 后，在5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液至于5 mL EP 管中，使用氮吹儀吹干，殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相150 μL，超聲震蕩溶解，在5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液進(jìn)行上樣。

1.2.3 LC-MS 條件色譜柱：ACQUITY BEH C 18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL·min-1；樣量：2 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫：0～7 min：5%～12%A，7～25 min：11%～

22%A，25～40 min：22%～71%A，40～45 min：71%～80%A，45～46 min：80%～100%A，46～47 min：100%A，47～50 min：100%～5%A。

Xevo G2-XS Tof MS 飛行時(shí)間質(zhì)譜：離子化模式：ESI-；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L·h-1；MSE低碰撞能量：4.0 V；MSE高碰撞能量：10～45 V；質(zhì)量范圍（m/z）：50～1 200；ESI－模式（m/z）299.0558（香葉木素）。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠尿液中TMF 代謝產(chǎn)物的分析鑒定通過與空白尿液比較，在含藥尿液中共篩選出4 個(gè)化學(xué)成分，含藥尿液總離子流圖及M1-M4 的色譜圖見圖1。結(jié)合對照品、色譜保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、多級碎片離子等信息分析，共鑒定了4 個(gè)TMF 代謝產(chǎn)物，其二級圖譜見圖2，其裂解途徑見圖3。

M1 在m/z 503 處呈現(xiàn)［M-H］－準(zhǔn)分子離子，并分別在m/z 1007、327、312、297、269 處呈現(xiàn)［2M-H］－、［M-H-GluA］－、［M-H-GluA-2CH3］－及［M-H-GluA-3CH3-CO］－的碎片離子。M1 被初步推定為木犀草素的三甲基化及葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

M2在m/z 407處呈現(xiàn)［M-H］－準(zhǔn)分子離子，并分別在m/z 327、312、297、269 處呈現(xiàn)［M-H-SO3］－、［M-HSO3-CH3］－、［M-H-SO3-2CH3］－及［M-H-SO3-3CH3-CO］－的碎片離子。M2 被初步推定為木犀草素的三甲基化及磺基化產(chǎn)物。

M3在m/z 327處呈現(xiàn)［M-H］－準(zhǔn)分子離子，并分別在m/z 312、297、269處呈現(xiàn)［M-H-CH3］－、［M-H-2CH3］－及［M-H-3CH3-CO］－的碎片離子。M3 被初步推定為木犀草素的三甲基化產(chǎn)物。

圖1 負(fù)離子模式下的色譜圖

圖2 M1-M4的二級質(zhì)譜圖

M4在m/z 299處呈現(xiàn)［M-H］－準(zhǔn)分子離子，并分別在m/z 284、256處呈現(xiàn)［M-H-CH3］－及［M-H-CH3-CO］－的碎片離子。經(jīng)與對照品比較，M4 被確認(rèn)為香葉木素。

經(jīng)SciFinder 數(shù)據(jù)庫檢索，M1 和M2 被初步鑒定為新化合物。

圖3 M1-M4的裂解途徑

3 討 論

藥物進(jìn)入體內(nèi)后在各種代謝酶的作用下，產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)形式的代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物有可能具有活性，當(dāng)它們進(jìn)入到相應(yīng)的靶點(diǎn)后，可發(fā)揮藥理作用，因此對藥物的體內(nèi)代謝進(jìn)行研究，有助于解釋藥物的體內(nèi)顯效形式，進(jìn)而揭示其藥效機(jī)制。本文采用UPLC-QTOF-MS 技術(shù)從小鼠尿液中鑒定出4 個(gè)代謝產(chǎn)物，為木犀草素的甲基化產(chǎn)物以及進(jìn)一步葡萄糖醛酸基化或磺基化的產(chǎn)物。研究結(jié)果提示，TMF 在小鼠體內(nèi)可能先經(jīng)過Ⅰ相水解脫除1個(gè)或多個(gè)甲基后，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)發(fā)生Ⅱ相代謝結(jié)合反應(yīng)如硫酸酯化、甲基化、葡萄糖醛酸化。這與文獻(xiàn)推測的代謝途徑較為一致［9］。本研究為闡明TMF 的體內(nèi)代謝途徑和顯效形式奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對其安全用藥和藥理機(jī)制研究均有一定參考價(jià)值。