張珊珊，楊江輝，鄧豪成，張 曼，劉 海，吳龍火，張 蕊

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2020級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院2017級制藥工程專業(yè)本科生；3.贛南醫(yī)學(xué)院2018級制藥工程專業(yè)本科生；4.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是現(xiàn)今非常流行的一種致殘性疾病［1］。它是一種常見的肌肉骨骼疾病，導(dǎo)致人們生理功能和生活質(zhì)量下降。在臨床上，該病的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)疼痛、骨骼脆弱、骨質(zhì)疏松、僵硬和運(yùn)動限制，偶爾會伴隨輸液和局部炎癥的不同程度的疼痛，而持續(xù)性的疼痛往往為該疾病后期的一個特征［2］。在組織學(xué)上，這種疾病的特點(diǎn)是軟骨表面的早期分裂，軟骨垂直裂口的形成，軟骨細(xì)胞的克隆，可變晶體沉積以及重塑［3］。但退行性疾病過程不僅影響關(guān)節(jié)軟骨，還涉及整個關(guān)節(jié)，包括亞側(cè)骨、膠囊、韌帶、突觸膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉［4］。

導(dǎo)致OA 的風(fēng)險因素有很多，如年齡、性別、肥胖、過度的關(guān)節(jié)使用、營養(yǎng)、骨礦物質(zhì)密度等［5］。目前OA 尚不可治愈，也沒有有效的治療方法來阻止其進(jìn)展?，F(xiàn)有的藥物治療，有些可以作用于關(guān)節(jié)軟骨，如合成代謝藥物Sprifermin，它是短的重組人FGF-18 蛋白，可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成［6］；有些可以作用于軟骨下骨，如破骨細(xì)胞抑制劑二磷酸鹽，它可以抑制破骨細(xì)胞的功能，在骨代謝異常的狀況下可降低骨量的丟失、提高患者的骨密度，有顯著抑制關(guān)節(jié)軟骨下骨骨量丟失的作用，保護(hù)軟骨下骨的骨微結(jié)構(gòu)，有助于改善軟骨附著結(jié)構(gòu)［7］。這些藥物使用的主要目的是能使患者病情有所緩解，但它們都無法明顯快速地影響疾病的進(jìn)展，而且某些藥物的慢性攝入可能導(dǎo)致不良反應(yīng)［8］。而且對于一些晚期嚴(yán)重的OA 患者還必須進(jìn)行關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

目前為止，OA 仍然是一種治療效果不佳且治療方案選擇有限的疾病，因此，探索OA 新的治療靶點(diǎn)是當(dāng)務(wù)之急。近年來隨著基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，其在研究各種疾病基因表達(dá)譜和尋找疾病相關(guān)基因中發(fā)揮了重要作用［9］?；蛐酒夹g(shù)高通量篩選得到的生物標(biāo)志物有可能作為與OA 相關(guān)的不同病理過程的衡量標(biāo)準(zhǔn)?？梢酝ㄟ^檢測OA 的軟骨降解，反映OA 相關(guān)的生物活性和為預(yù)測疾病進(jìn)展的進(jìn)程提供有用的診斷信息，細(xì)胞因子和酶以及細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白和蛋白酶的前體或降解產(chǎn)物，都有作為OA 生物標(biāo)志物的潛力［10］。盡管許多相關(guān)的研究正在進(jìn)行，但目前還沒有可靠的、可量化的、易于測量的生物標(biāo)志物來對骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷、治療和預(yù)后提供監(jiān)測。本研究從高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫下載了包含正常半月板組織、OA 患者半月板組織的基因芯片（GSE19060），利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析得到OA 相關(guān)的差異表達(dá)基因，并對其進(jìn)行功能富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選出核心基因，為OA 的防治提供篩查標(biāo)志及新的治療靶點(diǎn)，并以期從分子水平揭示OA的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源本研究中分析的基因表達(dá)數(shù)據(jù)是從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫下載。經(jīng)過仔細(xì)分析，選擇了芯片數(shù)據(jù)集GSE19060，其芯片平臺是GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 DEGs 數(shù)據(jù)處理用GEO2R 在線分析工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析正常半月板組織樣本和OA 半月板組織樣本，得到差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），篩選DEGs 的標(biāo)準(zhǔn)是：|logFC|≥2 及adjust P＜0.05，F(xiàn)C（Foldchange）是基因表達(dá)差異倍數(shù)。對得到的DEGs 使用Heml 1.0 繪制熱圖，以便直觀地看到上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的DEGs變化。

1.3 利 用GO 和KEGG 分 析DEGsGO（Gene Ontology）分析是大規(guī)模功能研究常用的分析方法，其對基因功能的研究可分為3 個方面，即生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）［11］。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是一個被廣泛使用的數(shù)據(jù)庫，它存儲大量有關(guān)基因組、生物通路、化學(xué)物質(zhì)、疾病和藥物的數(shù)據(jù)［12］。本研究中的GO 注釋分析和KEGG 路徑富集分析使用的是DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）工具數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）。選擇的標(biāo)準(zhǔn)是：P＜0.05和基因計數(shù)≥5。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因的確定利用在線數(shù)據(jù)庫STRING（Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes，http：//string-db.org/）檢索分析PPI信息，篩選的條件是：combined score＞0.4，之后利用Cytoscape 軟件（www.cytoscape.org/）將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化。在這個網(wǎng)絡(luò)中具有更高連接度的節(jié)點(diǎn)在維持整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性方面更為重要，Cytoscape 軟件中的插件CytoHubba 根據(jù)連接度來計算每個蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的分?jǐn)?shù)。在我們的研究中，分?jǐn)?shù)最高的前10個基因被確定為核心基因。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs 的篩選本研究選擇的芯片數(shù)據(jù)集是GSE19060 該芯片共包含8 例樣本，其中3 例正常半月板組織，5 例OA 半月板組織，基于篩選標(biāo)準(zhǔn)|logFC|≥2 及adjust P＜0.05，比較正常組織和OA 組織從GSE19060 中總共篩選出106 個DEGs，包括52個上調(diào)表達(dá)基因，54 個下調(diào)表達(dá)基因。對得到的DEGs進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 骨關(guān)節(jié)炎差異表達(dá)基因聚類圖

2.2 DEGs的功能富集分析將篩選得到的106個DEGs 用DAVID 做GO 和KEGG 富集分析，GO 的分析結(jié)果包括3個方面，即生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF），GO 分析結(jié)果（表1）表明DEGs 生物學(xué)過程主要和細(xì)胞外基質(zhì)的組織、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞因子的信號通路調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)；細(xì)胞組分主要和細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞膜、突觸后密集區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)元胞體、突觸后膜、軸突、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜有關(guān)；分子功能主要和肝素結(jié)合有關(guān)。KEGG分析結(jié)果（表1）顯示DEGs所涉及的信號通路主要是PI3K-Akt 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等過程。

表1 GO和KEGG富集分析結(jié)果

2.3 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用STRING 工具分析預(yù)測DEGs之間的蛋白質(zhì)相互作用。如圖2所示，PPI 網(wǎng)絡(luò)中總共涉及94 個節(jié)點(diǎn)蛋白和281 個相互作用關(guān)系，圖中的每一個圓點(diǎn)代表一個蛋白，紅色的圓點(diǎn)代表上調(diào)表達(dá)的蛋白，綠色的圓點(diǎn)代表下調(diào)表達(dá)的蛋白，兩個點(diǎn)之間的連線代表兩個蛋白具有直接作用的關(guān)系。一個蛋白如與多個蛋白都有線相連，則代表這個蛋白與多個蛋白均有相關(guān)作用關(guān)系，這就意味著，與一個蛋白相連接的蛋白點(diǎn)越多，代表這個蛋白在整個網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。

2.4 核心基因的確定使用Cytoscape 軟件以及插件CytoHubba，確定了PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的十大核心基因，結(jié)果如表2 所示，分別是SFRP4、SFRP1、ITGB2、EPHA4、ELN、IGFBP5、FMOD、SYNPO2、PITX2、DSP。為了直觀地看到這10 個核心基因之間的相互作用，用Cytoscape 軟件將這10個核心基因可視化，如圖3 所示，核心基因用黃色、橙色、紅色標(biāo)注，顏色越深的基因代表在整個網(wǎng)絡(luò)中起的作用越重要。

圖2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

表2 Cytoscape分析得到的10個核心基因

圖3 與OA相關(guān)的十個核心基因

3 討 論

OA 是一種復(fù)雜的疾病，通過結(jié)構(gòu)、機(jī)械和生物通路的共同作用，導(dǎo)致關(guān)節(jié)成分退化的疾病［13］，是一個發(fā)病過程緩慢且需要高效的修復(fù)過程，這個修復(fù)過程用來補(bǔ)償最初的創(chuàng)傷、代謝、系統(tǒng)變化，結(jié)果會導(dǎo)致關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)改變，但沒有癥狀的發(fā)生。然而，有一些人中，由于修復(fù)能力受損，無法得到補(bǔ)償，導(dǎo)致持續(xù)性組織損傷，最終出現(xiàn)明顯癥狀和“關(guān)節(jié)衰竭”［14］。其發(fā)病機(jī)制尚未明確，找到與之相關(guān)的信號通路和生物標(biāo)記物對治療和預(yù)防OA十分必要。

現(xiàn)在的很多研究都是探索單個基因?qū)A 的影響，但在OA 進(jìn)程中往往會涉及多個基因表達(dá)的改變，并且某些基因表達(dá)的改變還會影響其他基因的表達(dá)、基因之間相互作用，通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對OA 的發(fā)生發(fā)展起到作用，可見在多基因水平研究OA 的基因表達(dá)有助于闡明其發(fā)病機(jī)制?；蛐酒切乱淮母咄繖z測技術(shù)，可以同時檢測上萬個基因的表達(dá)水平，是一種研究基因組和基因間相互作用的有效手段［15］。

本研究首先從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫（GEO）下載骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)芯片數(shù)據(jù)（GSE19060），利用GEO2R工具篩選OA 和正常組織之間的DEGs，共發(fā)現(xiàn)106個DEGs，其中52個上調(diào)表達(dá)，54個下調(diào)表達(dá)。基因表達(dá)量的改變往往會造成生物體生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的變化，用GO 分析注釋發(fā)現(xiàn)主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)的組織、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞因子的信號通路調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞膜、突觸后密集區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)元胞體、突觸后膜、軸突、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜、肝素結(jié)合等。KEGG 信號通路分析發(fā)現(xiàn)主要和PI3K-Akt 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等過程相關(guān)。之后用STRING 工具構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，由Cytoscape 軟件將DEGs 可視化，并篩選出SFRP4、SFRP1、ITGB2、EPHA4、ELN、IGFBP5、FMOD、SYNPO2、PITX2、DSP 等10 個連接度最高的與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)的核心基因。

我們對得分最高的3個蛋白進(jìn)行了文獻(xiàn)的查閱和研究進(jìn)展的總結(jié)。分泌卷曲蛋白相關(guān)蛋白4（Se?creted frizzled related protein 4，SFRP4）和分泌卷曲蛋白相關(guān)蛋白1（Secreted frizzled related protein 1，SFRP1）是SFRP 家族的一員，該家族含有一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，與卷曲蛋白的Wnt結(jié)合位點(diǎn)同源。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)是軟骨發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和退化的主要調(diào)節(jié)途徑，SFRPs是Wnt信號的可溶性調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是Wnt蛋白的拮抗劑。CARMEN GARCIA-IBARBIA等研究發(fā)現(xiàn)在優(yōu)勢比為2.73 的女性中，SFRP4 與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)，該分子以性別和關(guān)節(jié)特異性的方式影響大關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易變性［16］，但是具體的作用機(jī)制并沒有做深入的研究。S THYSEN 等發(fā)現(xiàn)在OA 進(jìn)程中，SFRP1 主要在軟骨下骨中發(fā)揮作用，而不是在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用［17］。SFRP1 基因缺失能增加小梁骨量，減少成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡［18］。此外，SFRP1 還可能通過結(jié)合核因子-kappaB配體（Nuclear factor-kappaB ligand，RANKL）抑制破骨細(xì)胞形成，核因子-kappaB 配體是成骨細(xì)胞表達(dá)的配體，通過與其同源信號受體RANK15 相互作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化［19］。在STR/ort 小鼠中，SFRP1 表達(dá)的減少不僅導(dǎo)致Wnt/catenin 信號激活增加，而且使關(guān)節(jié)軟骨易于過早老化和促進(jìn)OA 的發(fā)展［20］。整合素亞基β2（Integrin subunit beta 2，IT?GB2）的基因編碼一個整合素鏈，它與多個不同的鏈結(jié)合形成不同的整合素異源二聚體，整合素是整合的細(xì)胞表面蛋白，參與細(xì)胞粘附以及細(xì)胞表面介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，該編碼蛋白在免疫反應(yīng)中起重要作用，該基因的缺陷導(dǎo)致白細(xì)胞粘附缺陷［21］。ITGB2在許多芯片研究分析中都發(fā)現(xiàn)與OA相關(guān)［22-23］，但是相關(guān)的具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證尚比較缺乏，有待進(jìn)一步研究。EPH 受體A4（EPH receptor A4，EPHA4）屬于蛋白酪氨酸激酶家族的ephrin 受體亞家族，目前沒有其與OA有關(guān)的報道，值得進(jìn)一步研究。