王朱健 黃霏霏 龔一帆 湯荔 曹文俊 張朝然

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗(yàn)科 上海 200031；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是當(dāng)今世界上危害最嚴(yán)重的感染性眼病之一，由單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)感染所引起，因其致盲的病例數(shù)可占角膜病致盲的63.2%，而且近年來由于抗生素、激素及其他免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。目前臨床上對(duì)HSK主要還是依靠病史、典型癥狀和角膜病變的形態(tài)特征來進(jìn)行診斷，但HSK的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，常不典型，與其他一些角膜炎相混淆，容易造成誤診或漏診。因此需要一種無(wú)創(chuàng)、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法來為HSK提供實(shí)驗(yàn)室輔助診斷。

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測(cè)淚液中HSV DNA來診斷HSK國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道[3-5]，然而陽(yáng)性率并不高，且容易受HSK臨床類型及抗病毒治療影響，需要淚液HSV特異性抗體檢測(cè)作為補(bǔ)充。目前淚液HSV特異性抗體的研究較少，且缺少臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)及系統(tǒng)性的診斷性能評(píng)估。我們檢測(cè)了105例HSK患者淚液中的HSV特異性免疫球蛋白A(HSV-IgA)濃度，評(píng)估淚液HSV-IgA檢測(cè)對(duì)HSK診斷的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料 病例組淚液標(biāo)本來自2013年9月～2019年3月本院就診患者，其中臨床診斷為單眼HSK患者105例，成功收集患眼淚液標(biāo)本105份(作為患眼組)，健眼淚液89份(作為健眼組)。在HSK患者中根據(jù)患眼角膜上皮熒光染色情況又分為上皮染色組(77例)及上皮完好組(28例)。另收集73例患有其他眼表疾病(瞼緣炎相關(guān)性角結(jié)膜病變、真菌性角膜炎、角膜白斑、翼狀胬肉等)的淚液73份，作為對(duì)照組。所有患者進(jìn)入研究隊(duì)列前了解本研究的過程和目的，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 淚液的采集與保存 用直徑0.5 mm的聚乙烯塑料毛細(xì)管置于下穹隆部結(jié)膜囊，利用虹吸作用采得雙眼淚液5～20 μL，分別打入eppendorf管，放置-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) HSV-IgA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Virion/ Serion (德國(guó))酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay， ELISA) classic，試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。淚液中的HSV-IgA水平以試驗(yàn)結(jié)果的OD值根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出，單位為U/mL。

1.2.3 主要儀器 TECAN sunrise酶標(biāo)儀(TECAN公司，瑞士)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用MedCalc 15.8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，采用Kolmogorov-Smirnov 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并使用Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗(yàn)比較2組間差異，2組間分類變量比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，通過受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC 曲線)對(duì)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行診斷性能分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

105例HSK患者，年齡8～83歲，平均年齡53歲，中位年齡57歲，其中男性72例、女性33例；73例對(duì)照組年齡7～74歲，平均年齡43歲，中位年齡46歲，其中男性42例、女性31例。病例與對(duì)照組間年齡(Z=1.308，P=0.190 9)和性別(χ2=1.824，P=0.176 8)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

HSK患者患眼、健眼以及對(duì)照組的淚液HSV-IgA水平比較及檢測(cè)結(jié)果見表1。患眼組淚液中的HSV-IgA水平要明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.521，P＜0.000 1)，也顯著高于健眼組(Z=5.226，P＜0.000 1)。健眼組淚液HSV-IgA水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.317，P=0.1880 )。

淚液HSV-IgA的ROC曲線分析見圖1。通過ROC曲線分析，當(dāng)淚液HSV-IgA臨床判斷值為9 U/mL時(shí)，可獲得最大約登指數(shù)0.573 1，敏感度為72.38%，特異度為84.93%，曲 線 下 面 積(area under curve，AUC)為0.788(P＜0.000 1，95%CI:0.720～ 0.845)。

表1 患者患眼、健眼、對(duì)照組淚液中HSV-IgA的檢測(cè)結(jié)果

圖1 HSK患者淚液HSV-IgA的ROC曲線

HSK患者按角膜上皮完整性分為上皮完好組及上皮染色組2組，上皮染色組HSV-IgA水平為(182.78±636.36)U/mL，明顯高于上皮完好組的(21.33± 31.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.000，P=0.002 7)。以＞9 U/mL作為陽(yáng)性判斷值，上皮染色組陽(yáng)性率為77.92%，上皮完好組陽(yáng)性率為57.14%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.456，P=0.063 0)。上皮染色組的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predict value，PPV)及陰性預(yù)測(cè)值(negative predict value，NPV)分別為84.51%和78.48%，而上皮完好組的PPV及NPV分別為59.26%和83.78%。上皮完好及上皮染色的2類HSK分別進(jìn)行ROC分析，獲得最優(yōu)臨床判斷值均為9 U/mL，曲線下面積分別為0.664和0.833。

3 討論

角膜上皮刮片進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)是HSV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)時(shí)、費(fèi)事，角膜刮片取材困難且有風(fēng)險(xiǎn)，故在臨床應(yīng)用上受到限制。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，淚液檢測(cè)逐漸成為輔助眼表疾病診療的有效方法，具有采樣安全、操作簡(jiǎn)便、患者依從性好、可多次采集、便于隨訪等優(yōu)點(diǎn)。HSK患者角膜上皮中的HSV可復(fù)制并釋放到淚液中，淚腺中的漿細(xì)胞受HSV刺激可合成大量的抗HSV的IgA，在發(fā)作的3～5 d內(nèi)達(dá)到峰值，產(chǎn)生的IgA通過上皮細(xì)胞的免疫球蛋白受體分泌到淚液中，構(gòu)成了眼免疫中一個(gè)非常重要的抗感染機(jī)制[6]。Pedersen等[7]最早提出淚液中的HSV-IgA可作為HSK一個(gè)診斷參考指標(biāo)，隨后的研究[8-11]報(bào)道也支持淚液的HSV-IgA檢測(cè)在HSK中的診斷價(jià)值。

Shoji等[9]采用Schirmer試紙條法采集淚液檢測(cè)HSVsIgA，靈敏度和特異度分別為49.2%和82.6%。我們的檢測(cè)方法靈敏度為72.38%，特異度為84.93%，靈敏度要稍高于Shoji等的結(jié)果，可能與淚液采集及處理方法、陽(yáng)性判斷值的選擇、病例數(shù)或病例的臨床類型有關(guān)。Schirmer試紙和毛細(xì)管采集淚液以及樣本保存和處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響有待于我們后續(xù)的研究結(jié)果。ROC曲線顯示AUC為0.788，說明通過檢測(cè)淚液中HSV-IgA的水平可有效區(qū)別HSK及非HSK角膜炎。淚液中HSV-IgA的顯著升高可高度提示HSK風(fēng)險(xiǎn)，為HSK的診斷及鑒別診斷提供依據(jù)。我們通過HSK病例及對(duì)照病例的ROC曲線分析得出淚液中HSV-IgA的最優(yōu)臨床界定值為9 U/mL，可為后續(xù)臨床快速診斷試紙條的研發(fā)提供參考。此外，淚液HSV-IgA的檢測(cè)經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，也更適合在臨床推廣應(yīng)用。

本研究結(jié)果的特異度為84.93%，即對(duì)照組有15.07%比例的眼表現(xiàn)淚液HSV-IgA陽(yáng)性，這些眼中的HSV-IgA可能來源于外周血。有研究[10]顯示淚液中的HSV-IgA水平與血清HSV-IgA水平存在著正相關(guān)，可能與M細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。當(dāng)外周血中存在著較高的HSV-IgA濃度時(shí)，則有可能引起淚液中IgA的相應(yīng)增高，從而影響淚液HSV-IgA診斷性能。如何通過淚液/血清的比例校正公式來判斷淚液中HSV-IgA的局部增生，進(jìn)一步提高診斷效率也是需要研究的問題。

試驗(yàn)結(jié)果中上皮染色組的HSV-IgA要顯著高于上皮完好組，說明上皮損傷的HSK有更強(qiáng)烈的局部黏膜免疫反應(yīng)，可能是由于上皮損傷的角膜中存在著更活躍的病毒復(fù)制，產(chǎn)生更多的病毒抗原刺激淚腺分泌IgA。這提示淚液中HSV-IgA這一指標(biāo)不僅能用于診斷，抗體水平的高低可能與疾病進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)，對(duì)HSK療效及復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的臨床價(jià)值有待更多病例及時(shí)間隨訪觀察。