石瑤瑤 崔玉雙 高宏程 陳晨

[1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)研究生院 濟(jì)南 250117；2.臨沂市人民醫(yī)院眼科 臨沂 276000；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 濰坊 261000]

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，一直以來(lái)都是研究熱點(diǎn)。DR通常被認(rèn)為是視網(wǎng)膜的微血管病變，它涉及血管壁的變化、毛細(xì)血管阻塞，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜滲漏、缺血、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、炎癥和新生血管形成?？p隙連接蛋白(connexin，Cx)廣泛存在于視網(wǎng)膜細(xì)胞中，2個(gè)相鄰細(xì)胞通過(guò)Cx形成縫隙連接通道，允許細(xì)胞之間直接信號(hào)交流，對(duì)維持細(xì)胞正常的生理功能意義重大。Cx43通道特性的破壞被認(rèn)為是視網(wǎng)膜疾病病理生理學(xué)的一部分[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，包括視網(wǎng)膜疾病在內(nèi)，大多數(shù)易受Cx43介導(dǎo)損傷的疾病，有2個(gè)共同的病理特征：慢性炎癥和血管破裂。然而，目前還不清楚通過(guò)Cx43通道介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊和細(xì)胞間微環(huán)境的改變是如何與DR的發(fā)展聯(lián)系在一起的?，F(xiàn)將近年來(lái)有關(guān)Cx43在DR發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展綜述如下。

1 Cx和縫隙連接通道

Cx是一個(gè)多基因蛋白質(zhì)家族，相對(duì)分子質(zhì)量為26～70 kDa。已在哺乳動(dòng)物中鑒定出各種縫隙連接蛋白基因，這些基因分為2個(gè)主要譜系：i類(lèi)或β類(lèi)(例如Cx 26、30、31、31.1和32)；和ii類(lèi) 或α組(例 如Cx 33、37、40、43和46)。人類(lèi)基因組中有21種不同的連接蛋白同種型，每種Cx都是根據(jù)其分子量命名的。6個(gè)Cx亞單位寡聚成六聚體，稱(chēng)為半通道或連接子。1個(gè)完整的縫隙連接通道由2個(gè)相鄰細(xì)胞的半通道對(duì)接產(chǎn)生，允許細(xì)胞之間直接信號(hào)交流，稱(chēng)為細(xì)胞間縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)?？p隙連接以“斑塊”的形式存在，在幾個(gè)到幾千個(gè)單獨(dú)的縫隙連接通道之間形成聚集體。形成半通道的連接蛋白可以是相同或不同類(lèi)型的亞基。此外，對(duì)接在一起形成縫隙連接的2個(gè)半通道可以是相同或不同類(lèi)型的六聚體。

縫隙連接通道可透過(guò)直徑約1 kDa 或1.5 nm的分子，并允許離子、代謝物和信號(hào)分子的快速交換。這些通道可以通過(guò)各種生理刺激和實(shí)驗(yàn)干預(yù)來(lái)打開(kāi)和關(guān)閉。幾個(gè)連接蛋白基因的靶向敲除模型也被用來(lái)證明這些通道對(duì)正常細(xì)胞生理學(xué)的功能意義。研究[1]表明，縫隙連接對(duì)許多細(xì)胞過(guò)程都很重要，包括細(xì)胞間的電耦合，并且能夠在多個(gè)細(xì)胞間傳達(dá)協(xié)同反應(yīng)信號(hào)。在不同的連接蛋白同種類(lèi)型中，Cx43在人體中最常見(jiàn)。它由包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心臟細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)，并與影響不同器官系統(tǒng)的疾病有關(guān)。Cx43縫隙連接通道已被證明在炎癥、細(xì)胞遷移和組織收縮中發(fā)揮作用[2]。

2 高糖環(huán)境下對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞中Cx43表達(dá)及其介導(dǎo)GJIC的影響

2.1 高糖下視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 高糖(high glucose，HG)條件可顯著降低Cx43的表達(dá)和GJIC活性，同時(shí)降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)和閉合蛋白(OCCLUDIN)的表達(dá)[3]。此外，在正常葡萄糖濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中使用siRNA下調(diào)Cx43表達(dá)，降低ZO-1和OCCLUDIN表達(dá)，并增加細(xì)胞單層通透性。重要的是，當(dāng)在HG條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞用Cx43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，可以消除HG誘導(dǎo)的Cx43下調(diào)，并將Cx43表達(dá)提高到接近正常水平，觀察到細(xì)胞單層通透性顯著降低。當(dāng)周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，與在正常葡萄糖濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的斑塊相比，在HG條件下Cx43斑塊的數(shù)量減少。此外，視網(wǎng)膜周細(xì)胞中Cx43水平降低顯示出GJIC活性降低。Huang等[4]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠房水和HG處理的視網(wǎng)膜母細(xì)胞培養(yǎng)基中的ADMA水平升高，通過(guò)增加周細(xì)胞的通透性和凋亡、Cx43的下調(diào)和GJIC的抑制而導(dǎo)致DR中血視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破壞。Cx43下調(diào)可能通過(guò)損害緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管通透性的發(fā)展。連接蛋白這種非傳統(tǒng)功能的異常行為獨(dú)立于GJIC，可能會(huì)導(dǎo)致DR中視網(wǎng)膜血管的通透性增加。這些結(jié)果表明HG條件下調(diào)Cx43表達(dá)，并損害周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的GJIC活性在DR中發(fā)揮作用。

2.2 HG下視網(wǎng)膜müller細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 在HG培養(yǎng)條件下，müller細(xì)胞的單一培養(yǎng)物以及müller細(xì)胞和周細(xì)胞的共培養(yǎng)物中GJIC活性均顯著降低[5]。這些結(jié)果提供了müller細(xì)胞之間以及müller細(xì)胞和周細(xì)胞之間的溝通在HG條件下受到損害的證據(jù)。此外，GJIC活性降低促進(jìn)了這些細(xì)胞的凋亡，類(lèi)似于以前關(guān)于視網(wǎng)膜血管細(xì)胞的報(bào)道。因此，HG誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜müller細(xì)胞中Cx43異常下調(diào)可能促進(jìn)DR相關(guān)的神經(jīng)、血管穩(wěn)態(tài)的破壞。

Cx43在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，將過(guò)量的細(xì)胞外K+通過(guò)細(xì)胞質(zhì)重新分配到由縫隙連接的邊緣星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，有助于維持局部穩(wěn)態(tài)。HG和糖尿病至少部分通過(guò)下調(diào)Cx43的表達(dá)來(lái)削弱腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJIC[6]。這表明，糖尿病介導(dǎo)的Cx43通道下調(diào)損害了星形膠質(zhì)細(xì)胞之間縫隙連接的形成，阻礙了細(xì)胞間的交流，從而抑制了細(xì)胞存活，最終導(dǎo)致糖尿病早期可見(jiàn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失。此外，研究[7]表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在早期DR血管系統(tǒng)和視網(wǎng)膜內(nèi)部功能障礙的變化中起著關(guān)鍵的作用。

2.3 HG下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮形成內(nèi)部BRB，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞形成外部BRB。在慢性高血糖應(yīng)激中，RPE細(xì)胞可能經(jīng)歷緩慢和漸進(jìn)的降解，導(dǎo)致外部BRB受損和中樞視力喪失。RPE細(xì)胞頂端的緊密連接在調(diào)節(jié)屏障中十分重要。然而，糖尿病損害了RPE細(xì)胞中緊密連接的超微結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致血管過(guò)度滲漏。有趣的是，大多數(shù)縫隙連接位于RPE細(xì)胞的緊密連接中，這表明縫隙連接與緊密連接的相互作用在RPE中可能很重要。HG顯著降低了大鼠RPE細(xì)胞中總細(xì)胞Cx43水平，并損害了GJIC活性。有趣的是，一種叫作反式白藜蘆醇的化合物被發(fā)現(xiàn)可以保護(hù)RPE細(xì)胞免受HG誘導(dǎo)的炎癥、Cx43下調(diào)和GJIC降解[8]。因此，靶向阻止RPE細(xì)胞中Cx43下調(diào)可能對(duì)維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)外BRB具有治療價(jià)值。

2.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子激活Cx43的磷酸化 Cx的生物合成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及特定Cx基因的轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸、組裝以及縫隙連接從細(xì)胞表面的形成和去除。Cx43特定位點(diǎn)的磷酸化可能在Cx43通道內(nèi)化和降解中起調(diào)節(jié)作用，從而影響GJIC。此外，連接蛋白磷酸化的作用可能因細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞周期階段、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和其他功能而異[9]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是已知在DR中驅(qū)動(dòng)血管通透性的主要血管生成細(xì)胞因子，也參與改變連接復(fù)合體，如縫隙連接或緊密連接。幾種視網(wǎng)膜細(xì)胞類(lèi)型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和RPE細(xì)胞，在缺氧時(shí)釋放VEGF，導(dǎo)致血管生成和血管通透性增高。有趣的是，VEGF通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞中的促分裂素原活化激酶磷酸化Cx43來(lái)破壞GJIC[10]。具體來(lái)說(shuō)，糖尿病引起的VEGF升高可導(dǎo)致蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的活化，PKC隨后可增加Cx43、ZO-1和OCCLUDIN的磷酸化。ZO-1和OCCLUDIN磷酸化的增加可以促進(jìn)血管通透性，而磷酸化的Cx43可以使GJIC降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3 Cx43半通道與DR

3.1 Cx半通道 Cx半通道已被證明與縫隙連接功能無(wú)關(guān)的特定作用，這些半通道介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外微環(huán)境之間分子的通過(guò)。與GJIC相比，連接蛋白半通道在“靜止”條件下對(duì)細(xì)胞中的小分子(＜1 kDa ) (例如ATP、NAD+、前列腺素和小熒光染料)和離子顯示出非常低的打開(kāi)概率和(或)低的膜滲透性。然而，這些通道的激活或開(kāi)放涉及自分泌/旁分泌信號(hào)，這提供了ATP、谷氨酸釋放的途徑。NAD+和前列腺素可介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)和功能的各個(gè)方面。半通道活性通過(guò)連接蛋白亞基的翻譯后修飾來(lái)調(diào)節(jié)，例如S-亞硝基化、磷酸化和去磷酸化；膜物理化學(xué)條件，例如膜電壓、pH值、機(jī)械刺激和單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的濃度；通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)分子，例如ATP和親脂性分子來(lái)調(diào)節(jié)[11-12]。盡管在正常生理?xiàng)l件下，連接蛋白半通道的開(kāi)放概率很低，但在某些刺激條件下，包括組織損傷、炎癥和病理?xiàng)l件下，例如在缺血或缺氧應(yīng)激下，半通道打開(kāi)，形成病理膜孔[13]，半通道被過(guò)度激活。半通道的異常活動(dòng)與繼發(fā)性組織損傷有關(guān)，包括水腫、血管完整性受損和神經(jīng)元死亡[1]。因此，病理狀態(tài)下過(guò)度激活連接蛋白半通道主要導(dǎo)致正常穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞功能的破壞。

3.2 視網(wǎng)膜缺血再灌模型中Cx43半通道的異常開(kāi)放 視網(wǎng)膜缺血是DR的一個(gè)重要病理特征，導(dǎo)致血管完整性的喪失。視網(wǎng)膜缺血再灌注被認(rèn)為是研究動(dòng)物DR的主要模型之一。在體外模擬缺氧、缺糖、缺血過(guò)程中，研究Cx43半通道在缺血再灌注損傷中的作用。Kerr等[14]研究表明，Wistar大鼠單側(cè)視網(wǎng)膜缺血性損傷顯著增加了缺血性和對(duì)側(cè)視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞、müller細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43的表達(dá)，但損傷的假對(duì)照中沒(méi)有。Danesh-Meyer等[1]解釋說(shuō)，隨著Cx43的增加，細(xì)胞表面半通道募集增加，導(dǎo)致質(zhì)膜中未連接的半通道增加，這可能與細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境之間的旁分泌和自分泌信號(hào)有關(guān)。在視網(wǎng)膜中細(xì)胞損傷期間，視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43表達(dá)的增加與細(xì)胞間鈣波和死亡信號(hào)的增加相關(guān)[1]。鈣信號(hào)已被證明參與局部血流調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子釋放的誘導(dǎo)，這導(dǎo)致BRB分解。血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx43的增加也已被證明通過(guò)半通道介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞破裂直接影響B(tài)RB功能，導(dǎo)致體內(nèi)血管滲漏[1]，這與其他炎癥損傷和典型的血管完整性喪失疾病一致。在眼壓升高以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜缺血的體內(nèi)研究中，損傷后1 h就觀察到內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)升高，并且在再灌注后4 h觀察到明顯的血管回流和滲漏[15]。這些變化也與膠質(zhì)增生有關(guān)，其特征是星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)增加。因此，Cx43半通道上調(diào)似乎是缺血的早期過(guò)程，可能引發(fā)血管滲漏的炎癥機(jī)制，并在慢性炎癥條件下持續(xù)存在。

在體外內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中，缺氧后再灌注導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡，應(yīng)用Cx43半通道阻滯劑可防止內(nèi)皮細(xì)胞死亡[16]。應(yīng)用Cx43模擬肽，即阻斷半通道的肽5，可減少缺血再灌注損傷引起的血管滲漏，提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率[15]。由于天然肽穩(wěn)定性差、遞送困難，為了增強(qiáng)天然肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，肽5被化學(xué)修飾成C12-C12-肽5，用這種修飾的肽治療可以減少血管滲漏、炎癥，并保護(hù)缺血損傷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[17-18]。最近有研究[19]發(fā)現(xiàn)，在缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43的條件性缺失維持了缺氧視網(wǎng)膜中星形膠質(zhì)細(xì)胞的較高密度，并促進(jìn)了血管恢復(fù)。因此，Cx43半通道開(kāi)放與缺血中發(fā)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損失有關(guān)[16]。

3.3 DR中炎癥與Cx43半通道的異常開(kāi)放 Mugisho等[20]最近發(fā)現(xiàn)，DR的臨床癥狀僅出現(xiàn)在玻璃體內(nèi)注射促炎細(xì)胞因子的糖尿病小鼠中，而注射鹽水的糖尿病小鼠沒(méi)有血管損傷的跡象。此外，他們將糖尿病性Akita小鼠和晚期DR的Akimba小鼠的Cx43表達(dá)與人類(lèi)DR患者供體視網(wǎng)膜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，在確診為DR的人供體視網(wǎng)膜中Cx43的表達(dá)顯著增加。僅當(dāng)高血糖和炎癥過(guò)程相結(jié)合時(shí)，在人體組織中觀察到的Cx43表達(dá)模式與體外RPE細(xì)胞數(shù)據(jù)以及體內(nèi)Akimba小鼠結(jié)果相關(guān)。有趣的是，在無(wú)炎癥的Akita小鼠中Cx43的表達(dá)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這可能支持其他研究結(jié)果，這些結(jié)果報(bào)告了僅使用HG模型而不是具有炎癥成分的DR中Cx43病理學(xué)的降低。此外，在確診為DR的Akimba小鼠和人類(lèi)供體視網(wǎng)膜中，Cx43表達(dá)的增加與血管滲漏和受損相關(guān)，這表明Cx43可能在疾病中出現(xiàn)的血管破裂發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。

3.4 Cx43半通道阻斷劑在DR治療中的前景 體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，阻斷Cx43半通道可通過(guò)阻斷激活NLRP3炎癥體所必需的自分泌三磷酸腺苷反饋環(huán)，有效地減少炎癥[22]。此外，阻斷NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3)炎 癥 體 可 阻 止VEGF的釋放，這表明Cx43半通道阻斷劑可在當(dāng)前抗VEGF治療的上游發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)得到了最近其他體內(nèi)研究的支持，其中發(fā)現(xiàn)Akimba小鼠的NLRP3炎癥體蛋白升高，但Akita和野生型小鼠沒(méi)有升高[23]。炎癥過(guò)程中，核因子κβ(nuclear factor-kappa β,NF-κβ)通路的激活導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子前體的產(chǎn)生。為了將這些細(xì)胞因子從它們的前體形式轉(zhuǎn)化為活性形式，前半胱天冬酶1必須被切割成活性半胱天冬酶1，這發(fā)生在NLRP3聚集(炎癥體復(fù)合裝配)期間。因此，NF-κβ與受Cx43半通道阻滯調(diào)控的NLRP3通路有直接關(guān)系。因此，抑制Cx43半通道有可能在疾病過(guò)程早期干預(yù)，首先預(yù)防炎癥，然后在慢性疾病中打破NLRP3炎癥體途徑中的自我延續(xù)反饋回路，這是DR的一個(gè)關(guān)鍵特征[22-24]。這些阻斷劑在視網(wǎng)膜疾病(如視網(wǎng)膜缺血[15]、年齡相關(guān)性黃斑變性[25]、DR[26])的嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型中能夠有效減少炎癥和血管滲漏。Cx43半通道阻斷劑能夠阻斷促炎細(xì)胞因子釋放和血管完整性喪失引起的免疫系統(tǒng)激活[22]。以這種方式，Cx43半通道阻斷劑在抗VEGF藥物的上游起作用，先減少炎癥體的活化和炎癥，有可能防止新血管形成，最終防止糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)的發(fā)生。

4 討論

臨床上DR分為非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。糖尿病早期可能主要是由于高糖引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、müller細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和RPE細(xì)胞中Cx43的表達(dá)下降，從而影響其介導(dǎo)的GJIC活性，GJIC活性降低可能造成毛細(xì)血管基底膜增厚、血管滲漏、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和炎癥。

DR早期血流變化可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的慢性炎癥，從而導(dǎo)致進(jìn)行性不可逆缺血、缺氧的發(fā)展，引起特征性微血管變化。氧化應(yīng)激以及炎癥都會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生VEGF，VEGF升高可導(dǎo)致PKC的活化，PKC的活化可增加Cx43、ZO-1和OCCLUDIN的磷酸化，從而促進(jìn)血管通透性增加，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

隨著DR病情的發(fā)展，正常的Cx43及其Cx通道表達(dá)繼續(xù)下降，此時(shí)機(jī)體可能代償增加Cx43的合成。隨著Cx43的表達(dá)及其導(dǎo)致的細(xì)胞表面半通道募集，引起質(zhì)膜中未連接的半通道增加，這可能與細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境間的旁分泌和自分泌信號(hào)有關(guān)。

DME是NPDR視力喪失的最主要原因。組織損傷、炎癥和缺血、缺氧應(yīng)激下Cx43半通道異常表達(dá)增加，進(jìn)一步激活NLRP3炎癥體所必需的自分泌三磷酸腺苷反饋環(huán)，加重炎癥并促進(jìn)VEGF的釋放，視網(wǎng)膜血管通透性進(jìn)一步增加，從而導(dǎo)致DME的發(fā)生。

DR早期癥狀不易察覺(jué)，當(dāng)病情進(jìn)一步發(fā)展進(jìn)入PDR，新生血管形成、視網(wǎng)膜前纖維血管膜增生及牽拉性視網(wǎng)膜脫離，導(dǎo)致不可逆的視力喪失。因此，探究DR的發(fā)生機(jī)制和早期防治意義重大。研究Cx43在DR的發(fā)病機(jī)制中的作用，旨在探討預(yù)防、控制DR發(fā)生及發(fā)展，尋求降低該病致盲率的有效途徑。