劉 真，潘子杰，劉建恒，李 明，劉鍾陽，孫國飛，崔 翔

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院京南醫(yī)療區(qū),北京 100073;2.中國人民解放軍63650部隊醫(yī)院洛陽門診部,河南 洛陽 471003； 3.中國人民解放軍總醫(yī)院骨科醫(yī)學(xué)部，國家骨科與運動康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100853)

骨缺損是骨科的臨床常見病。骨缺損長度在一定范圍內(nèi)時骨組織可自行修復(fù)重建，但是當(dāng)缺損范圍超過長骨直徑的1.5倍(即為臨界骨缺損)時，骨組織無法自行愈合[1]。全球每年因嚴重創(chuàng)傷、感染、骨折后治療不當(dāng)、骨腫瘤或先天性疾病等導(dǎo)致的大段骨缺損患者超過200萬例，僅美國用于骨缺損治療的醫(yī)療花費就>50億美元[2]。

當(dāng)前臨界尺寸骨缺損治療的金標(biāo)準是自體骨移植[1]。然而，供區(qū)骨組織數(shù)量有限，術(shù)后供區(qū)骨缺損、疼痛、感染等多種并發(fā)癥嚴重限制了自體骨移植的推廣應(yīng)用。近年來，骨組織工程技術(shù)在骨缺損治療領(lǐng)域發(fā)展迅速，取得了良好的治療效果。特別是微納米尺度的生物支架可以更好地模擬天然細胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，具有良好的生物活性和機械性能，更好地促進成骨細胞的黏附、增殖和分化，是更理想的骨組織工程支架。因此，本文將對近年來骨缺損修復(fù)的微納尺度組織工程支架制備技術(shù)進行綜述，并對存在的問題及前景進行展望。

1 理想骨組織工程支架制備的要求

骨組織工程支架通過充當(dāng)細胞外基質(zhì)(ECM)在骨組織工程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為骨細胞的黏附、生長和維持自身生理功能提供了必要的機械支持和物理結(jié)構(gòu)，是骨組織再生的關(guān)鍵要素之一[2]。理想的組織工程骨支架，首先必須具有良好的骨傳導(dǎo)性以促進骨細胞的附著、增殖和遷移； 其次，還應(yīng)具有良好的骨誘導(dǎo)性以刺激原始骨細胞向成骨細胞分化； 另外，理想的骨組織工程支架應(yīng)具有血管化能力，通過改善營養(yǎng)和氧氣的輸送來促進骨組織再生。在微納米尺度上制備的骨組織工程支架，孔隙率高、比表面積大，在結(jié)構(gòu)和功能上能更貼近天然骨ECM，更加符合理想骨組織支架的要求[3-4]。

2 微納尺度組織工程支架的傳統(tǒng)制備技術(shù)

當(dāng)前，微納尺度支架是骨組織工程的研究熱點。傳統(tǒng)制備技術(shù)主要包括自組裝技術(shù)和熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)[5-6]：(1)自組裝技術(shù)是指微納米材料成分自發(fā)組織形成一定模式或結(jié)構(gòu)的技術(shù)。在自組裝過程中，基本結(jié)構(gòu)單元通過非共價鍵連接形成穩(wěn)定并具有一定規(guī)則的幾何結(jié)構(gòu)。(2)熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)是高溫下將聚合物溶解然后低溫冷卻，再通過萃取獲得一定結(jié)構(gòu)形狀的聚合物微孔膜。然而，自組裝技術(shù)或熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)制備的支架孔徑較小甚至無孔徑、三維結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定、力學(xué)性能較差，并且支架的降解性能也需要驗證。因此，上述技術(shù)目前在骨組織工程領(lǐng)域已不再單一使用，逐漸被新興技術(shù)所替代[7]。

3 新型微納尺度骨組織工程支架制備技術(shù)

靜電紡絲、3D(生物)打印和微流控是近年來制備微納尺度骨組織工程支架的常用技術(shù)，可以彌補傳統(tǒng)技術(shù)上的一些不足，更適宜用于理想骨組織工程支架的制備。

3.1靜電紡絲 靜電紡絲技術(shù)可簡便有效地制備微/納米纖維支架，其基本原理：聚合物溶液(或熔體)在高壓靜電作用下，利用電場力克服其表面張力形成噴射狀細流，細流在噴射過程中溶劑揮發(fā)，在收集器上固化形成微/納米纖維膜。靜電紡絲技術(shù)優(yōu)勢：(1)方法直接簡便、成本效益較好。靜電紡絲技術(shù)操作簡單、成本低廉，原料適應(yīng)性廣。多種高聚物均可以用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)微/納米纖維，包括合成高聚物、再生纖維素以及天然高聚物，如絲素或羊毛蛋白等蛋白質(zhì)類高聚物。針對熱塑性聚合物原料還可以采用熔體靜電紡絲法來生產(chǎn)微/納米纖維，且該技術(shù)生產(chǎn)速度比其他微/納米纖維生產(chǎn)技術(shù)要快許多[8]。目前，靜電紡絲技術(shù)是唯一可以用來規(guī)?；a(chǎn)微/納米纖維、且適合于制備各種聚合物微/納米纖維的組織工程技術(shù)。(2)電紡纖維膜孔隙率高、纖維細度和均勻度高、比表面積大、長徑比高，是一種可以模擬天然骨ECM的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Chakraborty等[9]通過使用90∶10(v/v)丙酮-水溶劑系統(tǒng)優(yōu)化該技術(shù)，生產(chǎn)出高度多孔的再生纖維素納米纖維，支持成骨細胞的增殖和黏附。Zhao等[10]通過電紡纖維技術(shù)制備了由聚乳酸、明膠和糖胺聚糖組成的合成/天然混合聚合物纖維網(wǎng)，該納米纖維網(wǎng)形態(tài)均勻，平均直徑<300nm，纖維膜空隙率高，且表面粗糙度與天然骨相似，較好地模擬了天然骨纖維的ECM結(jié)構(gòu)，可以很好地促進軟骨修復(fù)。(3)電紡纖維表面易功能化，可根據(jù)不同需求載入聚合物、無機物和生物大分子等，擴大了支架的應(yīng)用范疇。例如多種藥物、生長因子等可以通過與高分子聚合物混紡固定在纖維表面，形成生物活性涂層，在保持生物活性的同時達到局部緩釋的目的。Mohammadi等[11]在靜電紡絲技術(shù)制備的支架上負載BMP-2，結(jié)果顯示通過BMP-2的持續(xù)釋放促進了脊髓間充質(zhì)干細胞黏附和增殖，從而促進成骨分化，是優(yōu)秀的骨組織支架。

為了制造具有創(chuàng)新結(jié)構(gòu)和性能改進的復(fù)合納米纖維，科學(xué)家們又進一步提出了同軸靜電紡絲技術(shù)。同軸靜電紡絲技術(shù)可將聚合物[12-13]、低聚物[14]、無機化合物[15]、蛋白質(zhì)[13]和生物分子[16]等各種材料包覆在核殼結(jié)構(gòu)的核芯中。由于核芯成分和功能不同，核-殼納米纖維在構(gòu)成骨組織工程支架后展現(xiàn)的特性也不盡相同。Shao等[17]制作了以纖維蛋白雜交的羥基磷灰石為纖維核芯，柞蠶絲蛋白為殼的同軸電紡絲纖維，實驗證明該納米纖維機械強度高，有效支持了成骨樣細胞MG-63的增殖并促進了支架的生物礦化。Silva等[18]制造了結(jié)合聚癸二酸甘油酯(PGS)/聚己內(nèi)酯(PCL)的納米纖維(核芯：PGS/殼：PCL)，同時把可促進骨髓間充質(zhì)干細胞形成軟骨的通路激活劑Kartogenin(KGN)負載于PGS溶液中。結(jié)果顯示KGN能夠在支架局部可控、持續(xù)釋放，且顯著促進了成骨細胞的增殖分化和軟骨的形成。

雖然靜電紡絲技術(shù)已推出十多年，并且廣泛用于骨組織工程研究。但這種常規(guī)方法仍然存在局限性，例如電紡纖維無規(guī)則的取向、缺乏拉伸強度以及纖維直徑范圍大，均在一定程度上限制了骨組織支架的適用性。收集器是靜電紡絲中的重要組成部分，可通過調(diào)節(jié)收集器的速度來制備定向納米纖維。對齊的納米纖維有助于指導(dǎo)細胞黏附的順序，并促進細胞滲透、增強細胞活力。Ma等[19]制造了定向的聚乳酸(PLLA)納米纖維與骨髓基質(zhì)(BMS)細胞的復(fù)合支架，使細胞黏附性得到了明顯增強。如何將纖維平均直徑降低到20nm以下是靜電紡絲技術(shù)面臨的另一個挑戰(zhàn)。作為靜電紡絲全新的研究領(lǐng)域，電紡/網(wǎng)織(ESN)技術(shù)能夠生產(chǎn)纖維直徑<20nm的納米網(wǎng)，其機械性能更好，比表面積大且孔隙率高，可作為組織再生支架的合適候選者[20]。普通靜電紡絲方法制備的骨組織支架通常由一維納米纖維作為構(gòu)筑單元組裝而成，具有結(jié)構(gòu)難以精確調(diào)控、固有納米特性難以保持等局限性，限制了納米材料應(yīng)用性能的大幅提升。Zhang等[21]提出了一種高分子網(wǎng)狀纖維材料的新型加工技術(shù)—“靜電噴網(wǎng)”，獲得了纖維直徑10～40nm的二維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)材料。二維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不僅賦予了材料孔徑小、比表面積大、孔隙率高等納米特性，同時顯著增強了材料的機械性能，在骨組織工程領(lǐng)域?qū)⒂袃?yōu)異的應(yīng)用潛力。

靜電紡絲技術(shù)在醫(yī)學(xué)再生支架方向的應(yīng)用取得了令人矚目的進展，利用靜電紡絲技術(shù)可以成功地制備出結(jié)構(gòu)功能多樣的納米纖維支架。下一步可以通過材料改進、技術(shù)創(chuàng)新或與其他先進技術(shù)結(jié)合等方法，制備結(jié)構(gòu)更優(yōu)、機械性能更好、生物活性更強的靜電紡絲支架，更好實現(xiàn)骨缺損的修復(fù)。

3.23D生物打印 3D打印是在計算機的控制下，把數(shù)據(jù)模型按照設(shè)定方式，層層打印堆疊成立體實物的一種成型方式。3D打印作為精準醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)，在骨缺損的治療中已取得初步成效[22]。3D打印可根據(jù)不同患者個性化定制支架，實現(xiàn)支架與骨缺損部分的完美匹配。傳統(tǒng)3D打印技術(shù)雖然可精確控制支架的形狀、孔隙率、孔徑尺寸等，但打印過程中需進行高溫或其他特定處理，無法實現(xiàn)打印支架材料與生物活性材料(如細胞、生長因子、蛋白質(zhì)等)相結(jié)合。近年來隨著3D打印技術(shù)的不斷發(fā)展，生物打印技術(shù)應(yīng)運而生。該技術(shù)可以打印活細胞、生長因子、蛋白質(zhì)等生物活性分子以及具有良好生物相容性且可降解的生物材料，因此成為骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點[23-24]。

目前3D生物打印技術(shù)根據(jù)原理可概括為三類：噴墨式生物打印、微擠壓成型式生物打印和激光輔助生物打印。

(1)噴墨生物打?。涸摷夹g(shù)是基于普通噴墨打印機的打印原理，依靠熱或聲波擠壓墨盒內(nèi)的生物墨水，離散墨水成微滴并噴射出去。噴墨式生物打印的主要優(yōu)勢是打印速度快、成本低。該技術(shù)通過噴射的方式可以打印流體材料，因此具有很高的材料適用性； 同時通過精確沉積細胞和生物材料可以實現(xiàn)接近50μm的分辨率[25]。另外，噴墨式生物打印可針對性地配備多個噴嘴，以滿足在同一時間打印不同的細胞、生物材料或生長因子的需求[26]。然而，用于噴墨打印的生物墨水黏度要求限制了其適用生物材料的范圍。由于驅(qū)動壓力小，噴墨生物打印無法打印高黏度材料或高濃度細胞，而低黏度材料會降低骨組織支架的機械強度，不能滿足后續(xù)體外培養(yǎng)和移植的要求； 此外，噴墨打印過程中可能會對細胞造成機械或熱損傷，噴頭也易損耗，這些缺點限制了噴墨生物打印技術(shù)的廣泛應(yīng)用[27]。

(2)微擠壓3D打?。涸摷夹g(shù)工作原理是通過力學(xué)的推進，可控地將材料從噴口或針頭擠壓出來并沉積成預(yù)設(shè)支架。其最大的優(yōu)勢在于可打印的生物相容材料范圍廣泛，這意味該技術(shù)不但可打印為維持細胞活力和功能化提供合適ECM的低黏度材料，也可打印能為骨支架提供力學(xué)支持的高黏度材料[26-28]。同時，微擠壓生物打印也有良好的經(jīng)濟性和易用性等優(yōu)點，可以選擇不同的針頭大小，并且調(diào)節(jié)溫度和壓強來控制打印速率和分辨率。但微擠壓打印也存在一些缺陷：首先，其打印精度相對其他3D生物打印方式較低，一般在50～500μm； 其次，擠出過程中不可避免的剪切力可能會影響細胞存活率； 另外，打印材料黏度很高時，打印針頭容易堵塞[29-30]。

(3)激光輔助生物打印：該技術(shù)原理是利用激光使含有細胞的聚合物產(chǎn)生交叉鏈接，從而硬化形成固體。激光投射能夠達到很高的精確度(分辨率<5μm)，因此可以打印復(fù)雜的形狀及結(jié)構(gòu)[31]。激光輔助式生物打印相較于前兩者有著一個先天優(yōu)勢：其無噴嘴的打印模式避免了細胞/生物材料堵塞噴嘴的問題，同時也避免了生物墨水與器件的直接接觸，不會對細胞造成機械損傷； 另外，其生物材料的選擇范圍比噴墨打印更廣，可以打印超高黏度生物墨水，打印精度甚至能達到生成含單個細胞的液滴。而激光輔助打印也存在以下缺陷：(1)在印刷過程中，金屬激光吸收層蒸發(fā)，金屬殘留物可以在最終的組織工程產(chǎn)品中找到[31]； (2)印刷速度相對較慢； (3)單次打印對打印材料的利用率不如噴頭類打印高，在成本控制方面沒有很大競爭力[28]。

針對不同需求，研究者們利用3D打印技術(shù)開發(fā)了各種用途的納米骨組織支架。例如，為了突破細胞和生長因子只能單獨應(yīng)用于支架上的局限性，Gao等[32]設(shè)計了一種改進的熱噴墨生物打印技術(shù)。該技術(shù)可將干細胞、納米顆粒和生物材料同時沉積在精確的3D位置。Costa等[33]采用激光輔助打印技術(shù)生產(chǎn)了由PCL和poloxamine結(jié)合的負載地塞米松的3D打印支架，經(jīng)證明該支架能夠長期可控地把最佳量藥物遞送至靶細胞，促進成骨細胞分化。

3D生物打印技術(shù)在骨再生領(lǐng)域應(yīng)用最為成熟，可以更加精確地控制支架結(jié)構(gòu)和機械性能。但目前仍需克服一些技術(shù)難題，例如必須要提高生物打印機的分辨率才能打印出更加仿生的結(jié)構(gòu)。另外當(dāng)前的生物打印過程非常耗時。復(fù)合材料和混合3D打印可以改善傳統(tǒng)3D打印的一些限制條件(如材料選擇)。此外，還可以與其他實驗室技術(shù)(如微流控)結(jié)合使用，以改善骨骼的微環(huán)境并控制流體網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。

3.3微流控 微流控是指一種可以精確操控數(shù)十微米尺度流體的組織工程技術(shù)，能夠把生化分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析過程[34]。微流控技術(shù)在制備骨組織工程支架方面有以下優(yōu)勢。

(1)微流體系統(tǒng)可以在生產(chǎn)過程中對微纖維進行精確的尺寸和形態(tài)控制。微流體技術(shù)通過對微通道中微尺度液體流動的精確操控，可對形成的微纖維在尺寸和形態(tài)上進行精準控制。Angelozzi等[35]采用了雙入口蛇形微混合芯片使細胞與藻酸鹽-明膠水凝膠及藻酸鹽-膀胱基質(zhì)水凝膠均勻分布在微纖維內(nèi)，該支架可以促進細胞黏附、增殖和成骨分化，從而促進骨形成。微流體系統(tǒng)基于芯片的制造方法具有簡單、經(jīng)濟、生物相容性好的優(yōu)點。Santo等[36]就利用這些優(yōu)點設(shè)計了一種由血小板裂解物和甲基丙烯酸化結(jié)冷膠纖維組成的纖維狀水凝膠支架，在保持支架機械力的同時改善了細胞黏附和增生，可作為理想骨支架的選擇。

(2)微流體可以控制微氣泡的尺寸分布。在生產(chǎn)實心微纖維材料的基礎(chǔ)上，通過在微流控技術(shù)產(chǎn)生的柱狀噴射液流模板中引入致孔劑或使用溶劑揮發(fā)法，可以得到具有多孔結(jié)構(gòu)的微纖維。Colosi等[37]研發(fā)了一種能夠產(chǎn)生高度單分散氣泡的微流體氣體發(fā)泡技術(shù)，制備出孔隙均勻的多孔支架，以利于營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的擴散，促進骨支架的血管化形成。

(3)微流體平臺可在體外創(chuàng)建精確的骨微環(huán)境。微流體技術(shù)能夠創(chuàng)建對機械和化學(xué)參數(shù)(例如流速和相關(guān)的感應(yīng)力、氧氣張力、化學(xué)梯度和溫度)進行精確控制的微型設(shè)備。這些微裝置可以模擬不同的體外生物學(xué)和細胞微環(huán)境條件，以用于各種研究[34]。

另外，微流體還可用于生產(chǎn)納米顆粒。Hasani-Sadrabadi等[38]使用微流體技術(shù)生產(chǎn)包覆地塞米松的殼聚糖納米顆粒，研究表明這些納米粒子比常規(guī)合成的納米粒子的尺寸更小且均勻，包覆的地塞米松可在細胞內(nèi)持續(xù)緩慢釋放，促進成骨細胞分化。

血管生成是組織工程中的關(guān)鍵問題。Del Amo等[39]使用微流控平臺作為模型來量化評估不同血管生成因子對1型膠原蛋白支架發(fā)芽的影響。最終發(fā)現(xiàn)，BMP-2是唯一在較長時間內(nèi)具有正向調(diào)控性的生長因子。Jusoh等[40]為改善血管生成在微流體平臺上建立了一個結(jié)合羥基磷灰石和纖維蛋白水凝膠的3D微血管網(wǎng)絡(luò)模型。研究結(jié)果表明，羥基磷灰石和纖維蛋白水凝膠的結(jié)合可以增加支架的剛度，更好地引導(dǎo)3D環(huán)境中內(nèi)皮細胞的伸長和發(fā)芽。

迄今為止，微流體裝置在骨組織再生方面的應(yīng)用潛力仍未被充分開發(fā)。而復(fù)雜的微流體平臺通過使用新穎的微/納米工程技術(shù)和計算模型可以優(yōu)化生物支架的細胞基質(zhì)和微環(huán)境。因此，該技術(shù)的出現(xiàn)將極大地推進仿生組織工程的發(fā)展。

4 挑戰(zhàn)與展望

隨著骨缺損患者數(shù)量的逐年增加，尋找自體骨移植更適宜的替代方法成為目前研究的熱點。研究者們開發(fā)了由仿生支架、干細胞和生長因子組成的骨移植替代物，并且骨組織工程支架和各種材料的研究已取得了重大進展。目前，靜電紡絲、3D生物打印、微流控等技術(shù)已成功地應(yīng)用于微納米尺度的骨組織工程領(lǐng)域，許多報道已證實這些技術(shù)制備的支架可更好促進成骨細胞黏附、成骨分化和組織形成，展示出強大的骨缺損修復(fù)能力。

迄今為止，開發(fā)具有真正臨床意義的骨支架仍然面臨很多挑戰(zhàn)。首先，達到理想骨組織工程支架的要求要顧及很多方面，例如支架的血管化能識別適當(dāng)?shù)臋C械刺激，調(diào)節(jié)生物活性劑和生化試劑的可控釋放，改善嵌入支架的細胞植入等。上述每個方面的優(yōu)化均是一個復(fù)雜過程，也需要大量的臨床經(jīng)驗。其次，在大規(guī)模生產(chǎn)的同時要保證符合良好的生產(chǎn)規(guī)范，并具有較高成本效益和臨床安全性。最后是生產(chǎn)制造協(xié)議的標(biāo)準化，需要考慮到政府相關(guān)組織的審批、成本效益等方面的問題。

今后隨著多學(xué)科交叉的不斷深入，將生物學(xué)、工程學(xué)和材料學(xué)相融合； 臨床醫(yī)師和生物工程師的密切合作以及新興技術(shù)如計算機建模等的不斷出現(xiàn)，組織工程支架將會迎來更好更快的發(fā)展。相信在不久的將來，更加符合骨缺損修復(fù)要求的理想人工骨移植材料將會應(yīng)用于臨床，為大段骨缺損的治療提供新思路，造福廣大患者。