葉宇歆，曾還雄，陳柳汕，汪潔，劉文彬，金小寶，沈娟

（廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006）

金黃色葡萄球菌是人體皮膚和鼻腔的常見定植菌，也是引起臨床感染的常見致病菌，可引起局部化膿性感染及肺炎、骨髓炎、腦膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、膿毒癥等全身性感染[1]。由于臨床上抗生素使用的不合理性和細菌本身的進化，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥性逐漸增強，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌嚴重影響人類健康，如何防治金黃色葡萄球菌感染已成為全球關(guān)注的焦點[2]。

放線菌是重要的藥用微生物資源，超過75%的抗生素均來源于放線菌[3]。菌株WA23?4?4是本課題組從傳統(tǒng)昆蟲類中藥材蜚蠊腸道中分離得到的1株鏈霉菌屬放線菌，前期生物活性篩選發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液粗提物具有較強的抗金黃色葡萄球菌活性[4]。為了探究其中的抗金黃色葡萄球菌活性成分，本研究對該株菌進行了大規(guī)模發(fā)酵，經(jīng)過化學(xué)分離和波譜鑒定得到10個化合物，通過體外活性測試，擬篩選出抗金黃色葡萄球菌活性的次級代謝產(chǎn)物。

1 材料與儀器

1.1 菌株來源

菌株WA23?4?4課題組從蜚蠊腸道分離得到，-80℃甘油保存；金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC 25213）購自廣東省微生物研究所。

1.2 試劑與儀器

放線菌培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；柱層析用二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國霍尼韋爾國際公司）；氘代甲醇、氘代丙酮、氘代三氯甲烷、氘代DMSO（美國劍橋CIL公司）；柱色譜硅膠（煙臺江友硅膠有限公司）；葡聚糖凝膠（美國Amersham Pharmacia公司）。

U?2900紫外光譜儀（日立高新技術(shù)公司）；VERTE 70紅外光譜儀、Advance III?600型核磁共振譜儀（德國BRUKER公司）；UPLC/Q?Tof 6230質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株發(fā)酵和乙酸乙酯粗提物總浸膏的制備將菌株WA23?4?4的種子液按10%的接種量接種于250 mL/500 mL的三角錐形瓶中，共計160瓶（100 L），28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)發(fā)酵7 d后進行收集，4 000 r/min離心15 min，發(fā)酵液的上清液用乙酸乙酯等體積萃取4次，萃取液合并后進行減壓濃縮蒸干，獲得乙酸乙酯粗提物總浸膏6.8 g（E）。

2.2 菌株次級代謝產(chǎn)物分離

將浸膏（E）經(jīng)硅膠柱層析（200～300目）分離，三氯甲烷?丙酮梯度洗脫，TLC檢測合并得到7個部分（E?1～E?7），E?1、E?2、E?7未分離到化合物。E?3經(jīng)葡聚糖Sephadex LH?20凝膠柱色譜（三氯甲烷?甲醇，體積比1∶1）分離，TLC檢測合并得到4個部分（E?3?1～E?3?4），E?3?2經(jīng)硅膠柱層析（200～300目）分離，石油醚?丙酮梯度洗脫，葡聚糖Sephadex LH?20凝膠柱色譜（三氯甲烷?甲醇，體積比1∶1）分離，半制備型高效液相（甲醇?水系統(tǒng)）分離，得化合物1（4.3 mg）、2（18.3 mg）和3（83 mg）。E?3?4經(jīng)硅膠柱層析（200～300目）分離，石油醚?丙酮梯度洗脫，TLC檢測合并得到3個部分(E?3?4?1～E?3?4?3)，E?3?4?1經(jīng)制備型高效液相（甲醇?水系統(tǒng)）分離，得化合物8（10.9 mg），E?3?4?3經(jīng)葡聚糖Sephadex LH?20凝膠柱色譜，三氯甲烷?甲醇（體積比1∶1）等度洗脫分離，得 化 合 物7（85.9 mg）。E?4經(jīng) 葡 聚 糖Sephadex LH?20凝膠柱色譜（三氯甲烷?甲醇，體積比1∶1）分離，硅膠柱層次（200～300目）分離，石油醚?丙酮梯度洗脫，半制備型高效液相（甲醇?水系統(tǒng)）分離，得化合物9（84 mg）、4（18.7 mg）。E?5經(jīng)三氯甲烷甲醇葡聚糖Sephadex LH?20凝膠柱色譜分離，硅膠柱層析（200～300目）分離，石油醚?丙酮（體積比1∶0～0∶1）梯度洗脫，半制備型高效液相（甲醇?水系統(tǒng)）分離，得化合物5（11.3 mg）和10（11.7 mg）。E?6經(jīng)三氯甲烷甲醇葡聚糖Sephadex LH?20凝膠柱色譜分離，硅膠柱層析（200～300目）分離，石油醚?丙酮（體積比1∶0～0∶1）梯度洗脫，半制備型高效液相（甲醇?水系統(tǒng)）分離，得化合物6（11.2 mg）。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、核磁共振光譜（NMR）、質(zhì)譜（MS）等技術(shù)對分離得到的10個化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，包括7個環(huán)二肽類化合物（化合物1、2、3、4、5、6、10），3個生物堿類化合物(化合物7、8、9）。

化合物1：白色晶體，易溶于甲醇；HR?ESI?MS m/z：197.128 9[M+H]+(calcd.for C10H16N2O2,197.1285)。

1H NMR（500 MHz,丙酮）δ：6.92(brs,1H,NH),4.14(t,J=8.0 Hz,1H,H?6),3.97(s,1H,H?3),3.52(dt,J=11.9,8.0 Hz,1H,H?9),3.41(ddd,J=16.2,8.2,4.1 Hz,1H,H?9),2.50(dtd,J=14.1,7.1,2.6 Hz,1H,H?1′),2.24(ddd,J=6.3,3.4,2.0 Hz,1H,H?7),2.21(d,J=6.9 Hz,1H,H?7),1.94(dd,J=2.7,1.6 Hz,1H,H?8),1.88(ddd,J=12.7,5.2,4.1 Hz,1H,H?8),1.12(d,J=7.3 Hz,3H,H?2′),0.95(d,J=6.9 Hz,3H,H?3′)。13C NMR（125 MHz，丙酮）δ：170.6(C?5),165.6(C?2),60.5(C?6),59.1(C?3),45.2(C?9),28.9(C?7),28.8(C?1′),22.8(C?8),18.6(C?2′),16.5(C?3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道一致，故鑒定化合物1為環(huán)(L?脯?L?纈)二肽[Cyclo(L?Pro?L?Val)]。

化合物2：白色晶體，易溶于甲醇；HR?ESI?MS m/z：211.143 9[M+H]+(calcd.for C11H18N2O2,211.144 1)。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ：6.66(brs,1H,?NH),4.07(t,J=8.0 Hz,1H,H?6),3.9(s,1H,H?9),3.6(dd,J=8.3,3.8 Hz,1H,H?3),3.55(dd,J=9.0,2.9 Hz,1H,H?3),2.38?2.34(m,1H,H?10),2.31(tdd,J=6.7,3.9,2.7 Hz,1H,H?5),2.06?2.00(m,2H,H?4),1.93?1.88(m,1H,H?4),1.43(ddd,J=13.3,7.6,3.9 Hz,1H,H?11),1.21(ddd,J=13.4,9.9,7.3 Hz,1H,H?11),1.07(d,J=7.2 Hz,1H,Me?10),0.93(t,J=7.4 Hz,1H,H?12)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ：170.33(C?1),165.19(C?7),60.61(C?9),58.85(C?6),45.21(C?3),35.42(C?10),28.61(C?5),24.09(C?11),22.42(C?4),15.86(Me?10),12.19(C?12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物2為環(huán)（S?脯?S?異亮）二肽[Cyclo(S?Pro?S?Ile)]。

化合物3：白色晶體，易溶于甲醇；HR?ESI?MS m/z：211.143 5[M+H]+(calcd.for C11H18N2O2,211.144 1)。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ：6.85(brs,1H,H?8),4.07(t,J=8.1 Hz,1H,H?6),3.96(dd,J=9.2,3.4 Hz,1H,H?9),3.53(s,1H,H?3a),3.52?3.48(m,1H,H?3b),2.29(dtd,J=9.9,6.9,3.0 Hz,1H,H?5a),2.09?2.03(m,1H,H?5b),1.98(dddd,J=15.6,11.5,7.6,3.8 Hz,2H,H?4),1.89?1.83(m,1H,H?10a),1.81?1.74(m,1H,H?11),1.49(ddd,J=14.3,9.3,5.0 Hz,1H,H?10b),0.94(d,J=6.6 Hz,3H,H?13),0.90(d,J=6.6 Hz,3H,H?12)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ：170.68(C?1),166.42(C?7),59.00(C?6),53.48(C?9),45.51(C?3),38.53(C?10),28.09(C?5),24.57(C?11),23.29(C?4),22.78(C?13),21.34(C?12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物3為環(huán)(R?脯?R?亮)二肽[Cyclo(R?Pro?R?Leu)]。

化合物4：白色晶體，易溶于甲醇；HR?ESI?MS m/z：283.104 5[M+Na]+(calcd.for C14H16N2O3,283.105 3)。1H NMR(500 MHz,丙酮)δ：8.41(s,1H,CONH),7.15(d,J=8.5 Hz,1H,H?2′,6′),6.76(d,J=8.5 Hz,1H,H?3′,5′),4.33?4.29(m,1H,H?1), 4.14?4.08(m,1H,H?1″),3.53(dt,J=11.6,8.1 Hz,1H,H?2a),3.40?3.33(m,1H,H?2b),3.21(dd,J=14.3,4.5 Hz,1H,H?5a″),3.02(s,1H),2.93(dd,J=14.3,6.9 Hz,1H,H?5b″),2.17?2.09(m,1H,H?2a″),1.84(ddd,J=8.1,5.9,3.5 Hz,1H,H?2b″),1.64(ddd,J=18.7,12.2,9.4 Hz,1H,H?4′′)。13C NMR(125 MHz,丙酮)δ：170.0(CO),166.0(CO),157.2,131.6(C?2′,6′),128.3(C?1′),116.0(C?3′,5′),59.6(C?1″),57.3(C?1),45.6(C?4″),36.3(C?2),28.9(C?2″),23.0(C?3″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道一致，故鑒定化合物4為環(huán)(L?脯?L?酪)二肽[Cyclo(L?Pro?L?Tyr)]。

化合物5：白色晶體，易溶于甲醇；HR?ESI?MS m/z：171.113 0[M+H]+(calcd.for C8H14N2O2,171.112 8)。1H NMR(600 MHz,DMSO)δ：8.24(s,1H),7.98(s,1H),3.83(d,J=17.3 Hz,1H,H?6a),3.66(td,J=6.9,3.0 Hz,1H,H?3),3.61(dd,J=17.3,3.2 Hz,1H,H?6b),1.81?1.72(m,1H,H?8),1.52(t,J=7.0 Hz,2H,H?7),0.88(dd,J=15.9,6.6 Hz,6H,H?9,10)。13C NMR(150 MHz,DMSO)δ：168.66(C?2),166.30(C?5),52.89(C?3),44.23(C?6),42.12(C?7),23.59(C?8),22.88(C?9),21.76(C?10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物5為環(huán)(甘?亮)二肽[Cyclo(Gly?Leu)]。

化合物6：白色晶體，易溶于甲醇。1H NMR(600 MHz,MeOD?d4)δ：6.99(d,J=8.5 Hz,2H,H?5,9),6.71(d,J=8.5 Hz,2H,H?6,8),4.22(m,1H,H?2),3.75(dd,J=7.1,1.3 Hz,1H,H?2′),3.17(dd,J=14.0,3.7 Hz,1H,H?3a),2.84(dd,J=14.0,4.7 Hz,1H,H?3b),0.58(d,J=7.1 Hz,3H,H?3′)。13C NMR(150 MHz,MeOD)δ：170.69(C?1),168.73(C?1′),157.96(C?7),132.76(C?5,9),127.05(C?4),116.29(C?6,8),57.58(C?2),51.73(C?2′),39.53(C?3),20.43(C?3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物6為環(huán)(丙?酪)二肽[Cyclo(Ala?Tyr)]。

化合物7：白色無定型粉末，易溶于甲醇；HR?ESI?MS m/z：163.040 9[M-H]-(calcd for C9H8O3,163.040 1)。1H NMR(500 MHz,MeOD?d4)δ：7.54(d,J=15.9 Hz,1H,H?7),7.40(d,J=8.6 Hz,2H,H?2,6),6.76(d,J=8.6 Hz,2H,H?3,5),6.24(d,J=15.9 Hz,1H,H?)。13C NMR(125 MHz,MeOD)δ：171.28(C?9),161.09(C?4),146.37(C?7),131.03(C?2,6),127.30(C?1),116.78(C?3,5),115.97(C?8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，故鑒定化合物7為反式對羥基肉桂酸(t rans?p?Hydroxycinnamic acid)。

化合物8：白色結(jié)晶，易溶于甲醇；HR?ESI?MSm/z：138.054 9[M+H]+(calcd.for C7H7NO2,138.055 0)。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：7.94(dd,J=8.4,1.5 Hz,1H,H?4),7.32(m,1H,H?6),6.69(d,J=7.6 Hz,1H,H?5),6.68(d,J=7.6 Hz,1H，H?3)。13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:173.73(-COOH),151.26(C?2),135.27(C?4),132.28(C?6),116.94(C?5),116.62(C?3),109.68(C?1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物8為鄰氨基苯甲酸(2?aminobenzoic acid)。

化合物9：白色粉末，易溶于甲醇；HR?ESI?MSm/z:202.083 8[M+Na]+(calcd.for C10H13NO2,202.083 9)。1H NMR(500 MHz,丙酮)δ：7.51(s,1H,4?OH),7.03(d,J=8.4 Hz,1H,H?2,6),6.77(d,J=8.4 Hz,1H,H?3,5),3.42?3.34(m,1H,H?8),2.69(t,J=7.5 Hz,1H,H?7),1.91(s,1H,H?11)。13C NMR(125 MHz,丙 酮)δ：171.10(C?10),156.80(C?4),130.63(C?1),130.37(C?2,6),116.02(C?3,5),41.93(C?8),35.45(C?7),22.84(C?11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物9為N?[2?(4?苯羥基)?乙基]乙酰胺{N?[2?(4?hydroxybenzoic)?ethyl]acetamide}。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇；HR?ESI?MSm/z：171.112 2[M+H]+(calcd.for C8H14N2O2,171.1128)。1H NMR(600 MHz,DMSO)δ：8.11(s,1H),7.98(s,1H),3.87(q,J=7.0 Hz,2H),3.67(s,1H),2.14(dtd,J=13.9,7.0,3.3 Hz,1H),1.26(d,J=7.0 Hz,3H),0.93(d,J=7.1 Hz,3H),0.82(dd,J=14.2,7.0Hz,3H)。13C NMR(150 MHz,DMSO)δ：168.69,165.95,59.37,49.66,40.05,20.07,18.49,16.86。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致，故鑒定化合物10為環(huán)(丙?纈)二肽[Cyclo(Ala?Val)]。

2.4體外抗金黃色葡萄球菌活性檢測

微量肉湯稀釋法測定單體化合物的抗金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性，采用MuAllArHi?nton（MH）肉湯培養(yǎng)基[15]。樣品檢測：取已滅菌的96孔板，從左往右第2至第11排，每孔加入已滅菌的MH培養(yǎng)基100μL，重復(fù)3個復(fù)孔，在第2孔加入已調(diào)好濃度的待測化合物100μL，然后吸取100μL至第3孔，混勻后再吸取100μL至第4孔，如此連續(xù)倍半稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100μL棄去，從上往下第E排為不含藥物的正常生長對照，第F排為陽性對照藥，第G排為只加培養(yǎng)基的空白對照。最終化合物的濃度為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL。再加入所測菌株菌懸液100μL（3～5×105cfu/mL，充分混勻，陽性對照為萬古霉素，10%甲醇溶劑為陰性對照），放置培養(yǎng)箱37℃孵育16～24 h，實驗平行3次。結(jié)果判斷：當陰性對照孔內(nèi)指示菌明顯生長時，96孔板中無菌生長即不渾濁的孔即為MIC孔。

結(jié)果顯示，化合物1、2、5對金黃色葡萄球菌ATCC 25923生長具有較強抑制作用（MIC值均為128μg/mL），化合物1、2對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC 25213生長具有一定的抑制作用（MIC值均為256μg/mL）。

3 討論

近年來耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA不斷增多，臨床上可供選擇的藥物極少，已成為難以治療的“超級細菌”，尋找新藥迫在眉睫[1?2]。昆蟲內(nèi)生微生物的代謝途徑非常特別，這為發(fā)現(xiàn)新的藥用微生物菌種、新的活性化合物提供了可能[4]。環(huán)二肽化合物具有抗菌、免疫功能調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用，生物堿類化合物具有生物來源多樣性、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性等特點，兩類化合物均具有較廣泛應(yīng)用價值[16?17]。本研究運用多種現(xiàn)代色譜分離方法和波譜鑒定技術(shù)從該菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取部位分離得到了10個化合物，包括7個環(huán)二肽類化合物和3個生物堿類化合物。本研究結(jié)果表明化合物1、2、5（均為環(huán)二肽類化合物）能夠抑制金黃色葡萄球菌生長（MIC值均為128μg/mL），并且化合物1、5能夠抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長（MIC值均為256μg/mL），提示化合物1、2、5可能是菌株WA23?4?4抗金黃色葡萄球菌生長的主要活性成分。本研究不僅揭示了昆蟲類中藥蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌WA23?4?4抗金黃色葡萄球菌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，而且提示昆蟲腸道內(nèi)生放線菌次級代謝產(chǎn)物可能具有藥用開發(fā)價值。