殷藝娜，馬 敏，芮琳琳，?？?/p>

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院麻醉科，江蘇213003；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院）

氯胺酮（Ketamine）作為N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體的非競爭性拮抗劑，是既能鎮(zhèn)靜又能鎮(zhèn)痛的全麻藥物，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)科和小兒外科手術(shù)麻醉中[1-2]。嬰幼兒處于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期，是神經(jīng)系統(tǒng)最脆弱、最容易受到損害的時期，全身麻醉藥是否影響患兒的大腦發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)[3-4]，氯胺酮是否對發(fā)育期大腦產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，是否對嬰幼兒遠(yuǎn)期發(fā)育及學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能產(chǎn)生影響存在較多爭議。斑馬魚體外受精胚胎透明、發(fā)育快速、繁殖力強(qiáng)，其生長發(fā)育過程、組織系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人類有很高的相似性，在基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能上具有很高的保守性，廣泛用于神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)損傷與退行性變、毒理、腫瘤、其他系統(tǒng)發(fā)育及疾病等多方面研究[5]。從20世紀(jì)60年代已有學(xué)者研究斑馬魚行為學(xué)，近20年斑馬魚作為模式動物在發(fā)育及藥物毒理等領(lǐng)域得到更多的關(guān)注和研究[6]。

本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動物模型，通過觀察其生長發(fā)育形態(tài)、自由運(yùn)動、驚恐反射活動和T迷宮等行為學(xué)反應(yīng)，探究不同濃度氯胺酮對斑馬魚胚胎、幼魚及成魚的神經(jīng)毒性作用，為氯胺酮在嬰幼兒麻醉中的安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 AB品系野生型斑馬魚，飼養(yǎng)和繁殖主要參照The Zebrafish Book[7]。光照/黑暗周期控制在14 h∶10 h，室溫與水溫控制在（28.5±1）℃。在實(shí)驗(yàn)前1日下午將7～10月齡成魚［雌∶雄（1～2）∶2］放入交配缸，用透明隔板將雌雄魚隔開，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天上午9時取走隔板，30～60 min后收集胚胎，挑去死亡（肉眼觀察下胚胎發(fā)白）魚卵，系統(tǒng)水清洗2遍后放入含有幼魚孵化液的培養(yǎng)皿中，置28.5℃孵化箱中孵育。參照KIMMEL等[8]描述的發(fā)育階段，在體式顯微鏡下剔除形態(tài)發(fā)育異常的胚胎，孵育至受精后24小時（24 hour post fertilization，24 hpf）時挑選形態(tài)正常的魚卵用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 試劑：鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司），斑馬魚幼魚孵化液（E3溶液，含5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4）。儀器：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生生物科技發(fā)展有限公司），體式顯微鏡（南京保利華科學(xué)器材有限公司），Noldus Ethovision X11.5斑馬魚視頻跟蹤系統(tǒng)（含T迷宮裝置，荷蘭）。

1.3 生長發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn) 氯胺酮暴露濃度選用0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，暴露時間分兩個階段，24～36 hpf和48～60 hpf。將24 hpf斑馬魚胚胎隨機(jī)分為5組，即對照組（E3溶液）及4個不同濃度（0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL）氯胺酮組，每組50±10枚胚胎，實(shí)驗(yàn)重復(fù)20次。分別在36 hpf和60 hpf時將處理組斑馬魚用系統(tǒng)水清洗2遍后全部更換為孵化液，對照組在48 hpf更換一半孵化液。以卵凝結(jié)和心臟停跳作為死亡終點(diǎn)，分別于72 hpf和6 dpf在體式顯微鏡下觀察記錄胚胎和/或脫膜后幼魚的死亡數(shù)、畸形數(shù)及幼魚孵化數(shù)，統(tǒng)計每組死亡率、畸形率和孵化率，并記錄主要畸形特征。

1.4 幼魚自由運(yùn)動分析 幼魚發(fā)育至6 dpf時，在體式顯微鏡下將外觀正常的幼魚逐條移入24孔板，每孔1條，放入Noldus幼魚運(yùn)動行為監(jiān)測儀內(nèi)適應(yīng)5 min后，應(yīng)用Ethovision XT 7.0軟件控制視頻跟蹤系統(tǒng)，采集3 min幼魚自由運(yùn)動視頻，導(dǎo)出其總運(yùn)動距離、平均運(yùn)動速度等參數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)選擇在幼魚運(yùn)動處于平臺期時段（12:00～15:00）進(jìn)行，觀察不同濃度氯胺酮暴露對幼魚運(yùn)動軌跡和運(yùn)動參數(shù)的影響。

1.5 幼魚對強(qiáng)光刺激的驚恐反射活動 幼魚在Noldus幼魚運(yùn)動行為監(jiān)測儀內(nèi)適應(yīng)5 min后，運(yùn)用Ethovision XT 7.0軟件設(shè)置5 min暗-1 min光照-5 min暗，采集11 min內(nèi)幼魚的運(yùn)動視頻，以光照期間以及光照結(jié)束后恢復(fù)期內(nèi)運(yùn)動距離的變化作為神經(jīng)行為學(xué)評價指標(biāo)，觀察氯胺酮暴露對幼魚驚恐反射活動的影響，判斷幼魚視覺或感覺運(yùn)動高級神經(jīng)回路的損傷情況。本實(shí)驗(yàn)時間時段為18:30～20:00。

1.6 成魚T迷宮實(shí)驗(yàn) 測試方法參考文獻(xiàn)[9]并略加改進(jìn)。T型迷宮由不透明的樹脂材料制成，主要由1個長臂（50 cm）和2個短臂（20 cm）構(gòu)成，臂寬10 cm，深10 cm，水位8 cm。在短臂一側(cè)連一個矩形水槽（22 cm×20 cm×15 cm），水槽外壁為黑色樹脂，內(nèi)有魚食?？紤]到斑馬魚為群居動物，在水槽內(nèi)放置一個透明玻璃燒杯，杯內(nèi)放4條成年斑馬魚，以吸引被測試斑馬魚，將此區(qū)域稱為富營養(yǎng)區(qū)（enriched chamber，EC)。行為學(xué)測試前2天，將60 dpf成年斑馬魚放在T迷宮長臂適應(yīng)1 h，測試共5天，測試時間為10:00～17:00，每條魚每次測試5 min。測試開始時將1條測試魚置于長臂起點(diǎn)，記錄斑馬魚從起點(diǎn)到進(jìn)入EC區(qū)的潛伏時間（只有完全進(jìn)入EC區(qū)并停留超過20 s，才認(rèn)為是真正進(jìn)入EC區(qū))。找到EC區(qū)后在EC區(qū)內(nèi)獎賞50只豐年蝦食物，觀察是否在EC區(qū)停留超過20 s。未找到EC區(qū)的斑馬魚，5 min測試完后將其引導(dǎo)進(jìn)入EC區(qū)，使其在EC區(qū)停留1 min。每條魚測試后放入有編號的透明獨(dú)立容器中，在測試期間被測試斑馬魚只有在EC區(qū)給予食物。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用GraphPad Prism 6軟件生成統(tǒng)計圖表。計量資料以Mean±SD表示，多組比較采oneway ANOVA或two-way ANOVA，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度氯胺酮暴露對斑馬魚幼魚形態(tài)發(fā)育的影響 在0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL氯胺酮組，從72 hpf至6 dpf胚胎生存率均高于99%，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。如圖1D（封二）所示，氯胺酮暴露濃度≥0.4 mg/mL時，72 hpf和6 dpf各組致畸率明顯升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?；沃饕憩F(xiàn)為頭部和鰓發(fā)育不良、脊索彎曲、短尾、卵黃突出、心包水腫并伴有細(xì)胞沉積等（圖1B、C，封二）。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，氯胺酮麻醉使用劑量0.2 mg/mL為亞麻醉劑量，0.4～0.8 mg/mL為臨床麻醉劑量，1.6 mg/mL為高于臨床麻醉劑量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明臨床麻醉劑量及高于臨床麻醉劑量的氯胺酮早期長時間暴露對斑馬魚胚胎和幼魚的發(fā)育有致畸效應(yīng)。

2.2 不同濃度氯胺酮暴露對幼魚自由活動的影響 幼魚3分鐘自由運(yùn)動結(jié)果顯示，各氯胺酮組幼魚運(yùn)動距離和運(yùn)動速度均高于對照組，以0.4 mg/mL氯胺酮組升高最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2A、B，封二），提示氯胺酮對幼魚的自由運(yùn)動產(chǎn)生興奮效應(yīng)，此現(xiàn)象與氯胺酮臨床不良反應(yīng)如誘發(fā)驚厥或因植物神經(jīng)功能紊亂誘發(fā)的煩躁癥狀類似。幼魚自由運(yùn)動軌跡如圖2C所示，與對照組相比，氯胺酮暴露組幼魚自由運(yùn)動軌跡增多、紊亂，并伴有刻板式轉(zhuǎn)向。

2.3 不同濃度氯胺酮暴露對光照誘發(fā)驚恐反射的反應(yīng)和適應(yīng)能力影響 在轉(zhuǎn)移至黑暗環(huán)境中適應(yīng)一段時間后，斑馬魚幼魚表現(xiàn)為靜息或平穩(wěn)游動。如果突然給予強(qiáng)光照射，正常幼魚對外界刺激的反應(yīng)表現(xiàn)為迅速靜止不動或游動速度明顯降低，而撤除光源后，幼魚最初表現(xiàn)為運(yùn)動活躍，后又逐漸減慢。如圖3所示，氯胺酮暴露濃度≤0.4 mg/mL時，幼魚在光照期的運(yùn)動距離小于黑暗期，與對照組類似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而1.6 mg/mL氯胺酮組幼魚在強(qiáng)光刺激后表現(xiàn)出運(yùn)動增強(qiáng)，其運(yùn)動距離大于黑暗期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明高濃度氯胺酮暴露后，可能導(dǎo)致斑馬魚對光線變化反應(yīng)敏感，但也不排除其對幼魚視力產(chǎn)生影響。與對照組相比，光刺激后進(jìn)入黑暗期1 min內(nèi)，0.4 mg/mL氯胺酮組幼魚運(yùn)動距離較對照組增加，興奮性活動異常增高，而其余3組在光照期后第1 min黑暗期內(nèi)運(yùn)動距離均低于同期對照組，表明亞麻醉劑量和高于臨床麻醉劑量氯胺酮暴露條件下幼魚對光線的適應(yīng)能力弱于對照組。值得注意的是，雖然各氯胺酮組幼魚在光暗后表現(xiàn)趨勢與對照組類同，但0.4 mg/mL氯胺酮組在光暗后第4 min運(yùn)動距離才趨向光照前運(yùn)動距離，而0.8、1.6 mg/mL氯胺酮組在光暗后第5 min運(yùn)動距離仍高于光照前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3（封二）。提示不同劑量氯胺酮暴露后，幼魚在驚恐后的恢復(fù)過程存在差異，0.4～1.6 mg/mL氯胺酮暴露可能存在一定程度的興奮效應(yīng)或視網(wǎng)膜發(fā)育毒性作用，進(jìn)而影響幼魚的暗適應(yīng)能力。

2.4 不同濃度氯胺酮暴露對成魚學(xué)習(xí)記憶功能的影響 如圖4A（封二），對照組斑馬魚經(jīng)過訓(xùn)練后，與第1天相比，測試第5天進(jìn)入EC區(qū)的潛伏時間顯著縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各氯胺酮組斑馬魚測試第5天進(jìn)入EC區(qū)的潛伏時間較對照組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與測試第1天相比，各氯胺酮組潛伏時間不降反增（圖4 A、B，封二）。對照組斑馬魚可在短時間內(nèi)進(jìn)入EC區(qū)吃食或?qū)ふ彝椋魈幚斫M中一部分斑馬魚表現(xiàn)為焦慮狀態(tài)，即在T迷宮短臂或長臂徘徊而不進(jìn)入EC區(qū)，或進(jìn)入EC區(qū)后又立即出來，并不去尋找魚群及食物，另一部分斑馬魚表現(xiàn)為抑郁狀態(tài)，即在T迷宮內(nèi)靜止不動（圖4 C、D，封二）。以上現(xiàn)象和結(jié)果提示氯胺酮呈劑量依賴性影響成年斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力，同時可能對其情緒產(chǎn)生影響。

3 討 論

氯胺酮可產(chǎn)生麻醉、鎮(zhèn)痛、抑制恐懼和焦慮以及遺忘作用，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)科和小兒外科麻醉中，其可能作用機(jī)制是通過非競爭性抑制NMDA受體，阻滯興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞而發(fā)揮作用。有研究顯示氯胺酮可以引起嚙齒類[11-13]或靈長類動物[14]發(fā)育期腦內(nèi)神經(jīng)元的變性死亡，并對動物的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生持久性損害。體外人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)顯示，氯胺酮可引起神經(jīng)元凋亡[15]。但也有學(xué)者認(rèn)為氯胺酮只有在作用時間足夠長，作用濃度足夠大時才會引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和認(rèn)知功能損害。

斑馬魚胚胎在24 hpf時原代神經(jīng)元開始分化并出現(xiàn)心跳，到48 hpf時腦室形成，發(fā)育到6 dpf時所有神經(jīng)系統(tǒng)形成，其形態(tài)發(fā)生在進(jìn)化上高度保守，神經(jīng)元的形成及分化等過程與其他脊椎動物相似[16]。由于斑馬魚血腦屏障在3 dpf才逐步完善[17]，胚胎時期神經(jīng)系統(tǒng)對外來毒物更為敏感。FéLIX等[10]將囊胚期（2~3 hpf）斑馬魚胚胎暴露于0.2，0.4，0.8 mg/mL氯胺酮20 min，發(fā)現(xiàn)氯胺酮呈劑量依賴性增加斑馬魚胚胎及幼魚的畸形率和死亡率。本實(shí)驗(yàn)室前期研究在斑馬魚胚胎早期（4~18 hpf）暴露于不同濃度氯胺酮，發(fā)現(xiàn)氯胺酮對24 hpf斑馬魚胚胎產(chǎn)生劑量依賴的死亡率和畸形率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，早期氯胺酮長時間多次暴露后，高于臨床劑量的氯胺酮明顯影響幼魚的形態(tài)發(fā)育，其致畸效應(yīng)呈劑量依賴性增加。KANUNGO等[18]將28 hpf斑馬魚胚胎暴露于0.55 mg/mL氯胺酮20 h后，盡管幼魚外形發(fā)育無明顯影響，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動神經(jīng)元明顯減少。

行為活動作為最敏感指標(biāo)，是機(jī)體通過自身機(jī)能的調(diào)整消除或減少損傷的表觀。行為學(xué)檢測雖然相對較簡單，但能從宏觀上早期發(fā)現(xiàn)外源性物質(zhì)引起的神經(jīng)功能性障礙，比病理學(xué)檢查更為直接、敏感。斑馬魚驚恐反應(yīng)于68 hpf產(chǎn)生，此時斑馬魚的眼睛正在形成，視網(wǎng)膜神經(jīng)元突觸也正在建立。發(fā)育至96 hpf后，幼年斑馬魚具有自由運(yùn)動的能力。因此，可通過對光照刺激引發(fā)的驚恐反應(yīng)能力和刺激撤除后行為恢復(fù)能力的變化，檢測由視覺引發(fā)的感覺運(yùn)動高級神經(jīng)回路是否正常[19]。本實(shí)驗(yàn)在6 dpf時于同一天對幼魚進(jìn)行自由運(yùn)動和強(qiáng)光刺激誘發(fā)的驚恐逃避反射實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示氯胺酮暴露組幼魚自由運(yùn)動的速度和運(yùn)動距離均較對照組增加，其運(yùn)動軌跡增多、紊亂；在暗適應(yīng)后給予強(qiáng)光刺激，處理組幼魚表現(xiàn)出對光照后的適應(yīng)能力減弱。尤其在高濃度氯胺酮組（0.8 mg/mL，1.6 mg/mL）幼魚運(yùn)動發(fā)生明顯異常，其光照期運(yùn)動距離較黑暗期不降反增，其原因是由于高濃度氯胺酮引起的神經(jīng)毒性還是視網(wǎng)膜受損還需進(jìn)一步探討。

T迷宮實(shí)驗(yàn)是一個檢測學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為模型[20]。本實(shí)驗(yàn)待幼魚發(fā)育至2個月后，進(jìn)行成魚T迷宮行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示，各濃度氯胺酮處理組成年斑馬魚經(jīng)過訓(xùn)練后并不能快速找到EC區(qū)，高于臨床麻醉劑量的氯胺酮則使成年斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力受到更嚴(yán)重的損傷，并可能對其情緒產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為焦慮與抑郁并存，但造成這種學(xué)習(xí)記憶能力變化的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，氯胺酮暴露濃度≥0.4 mg/mL時，胚胎期斑馬魚生長發(fā)育、自由運(yùn)動及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能均受到不同程度的影響，這種神經(jīng)毒性作用呈劑量依賴性，這為臨床上安全應(yīng)用氯胺酮進(jìn)行孕產(chǎn)婦和嬰幼兒麻醉提供有價值的參考。