巢萬(wàn)鵬

(汨羅市畜牧水產(chǎn)服務(wù)中心，湖南 汨羅 414400)

0 引言

生豬養(yǎng)殖過(guò)程中仔豬腹瀉是十分常見(jiàn)的臨床疾病，但可導(dǎo)致仔豬腹瀉的病因較多，包括病原感染、營(yíng)養(yǎng)不足甚至是毒素中毒等，其中病原包括有細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等[1-2]。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是導(dǎo)致仔豬腹瀉的常見(jiàn)腸道病毒，該病原感染仔豬可導(dǎo)致較高的發(fā)病率與死亡率，其中病畜臨床癥狀主要包括急性水樣腹瀉、嘔吐等，最終因嚴(yán)重脫水而死亡[1]。PEDV屬于冠狀病毒，該病原在1971年首次于英國(guó)被發(fā)現(xiàn)，其后在全世界各地豬群均有報(bào)道，如歐洲、亞洲和北美洲等地區(qū)。2010年以來(lái)我國(guó)多地區(qū)爆發(fā)PEDV變異株，且PEDV變異株的出現(xiàn)與流行給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

豬鏈球菌在我國(guó)豬場(chǎng)廣泛存在，其中部分血清型豬鏈菌(如血清2型)可感染人，因此該病原為重要的人畜共患性傳染病。豬鏈球菌感染豬群后可導(dǎo)致病畜出現(xiàn)嚴(yán)重的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等，若該病原通過(guò)病畜感染給養(yǎng)殖人員或消費(fèi)者，則導(dǎo)致人的急性腦膜炎或感染性中毒等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克或死亡。因此，豬鏈球菌的流行嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)對(duì)公共健康也造成巨大的威脅[4]。

2020年4月，湖南省汨羅市某規(guī)?；i場(chǎng)部分欄舍出現(xiàn)疫情，主要表現(xiàn)為仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐等，且部分仔豬關(guān)節(jié)腫大，并出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率。筆者通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷及實(shí)驗(yàn)室診斷等，最終判定為PEDV和豬鏈球菌混合感染，其詳細(xì)報(bào)告如下。

1 豬場(chǎng)發(fā)病情況

湖南省汨羅市某規(guī)模化豬場(chǎng)飼養(yǎng)繁殖母豬200余頭，2020年4月中旬，該場(chǎng)3號(hào)產(chǎn)房部分欄舍有仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀，其后飼養(yǎng)員對(duì)腹瀉仔豬口服抗生素，但腹瀉情況沒(méi)有得到好轉(zhuǎn)，且臨近欄舍豬群也開(kāi)始腹瀉和嘔吐等，至4月20號(hào)左右，該產(chǎn)房已有128頭仔豬腹瀉，死亡52頭。

2 臨床及病理癥狀

筆者進(jìn)入該場(chǎng)觀察發(fā)病豬群整體狀況，發(fā)現(xiàn)該場(chǎng)腹瀉仔豬糞便為黃色水狀，且肛門括約肌因高頻率腹瀉處于張開(kāi)狀態(tài)，少部分仔豬也出現(xiàn)嘔吐癥狀。此外，也發(fā)現(xiàn)有極個(gè)別仔豬關(guān)節(jié)腫大，手觸摸腫脹處有波動(dòng)感，但此類病豬沒(méi)有出現(xiàn)呼吸困難或神經(jīng)癥狀等。

對(duì)發(fā)病嚴(yán)重、具有臨床表現(xiàn)特征的2頭病豬進(jìn)行剖檢，可發(fā)現(xiàn)該病豬腹股溝和頜下淋巴結(jié)腫大并充血，關(guān)節(jié)處劃開(kāi)可見(jiàn)較為黏稠的濃汁，病豬的肺臟、肝臟和脾臟等未出現(xiàn)明顯的病理變化，可見(jiàn)腸壁變薄、腸系膜充血等，且小腸內(nèi)有黃色黏稠的液體等。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

無(wú)菌采集關(guān)節(jié)腔內(nèi)黏稠液體、腹股溝和頜下淋巴結(jié)，用高溫灼燒的接種環(huán)(冷卻后)蘸取少量組織液后在TSA鮮血瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，將培養(yǎng)基放置在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，每隔12 h觀察培養(yǎng)基表面是否有菌株及其生長(zhǎng)情況。若平板表明有菌株生長(zhǎng)，則對(duì)單一的菌株進(jìn)行涂片并染色鏡檢，觀察菌株的形態(tài)學(xué)特征，此外，采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的藥敏紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在仔豬的關(guān)節(jié)腔和淋巴結(jié)中均分離到菌株，其在TSA培養(yǎng)基表面可形成灰白色、濕潤(rùn)透明的菌落，且菌落周圍有溶血環(huán)，將單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并油鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽(yáng)性，且橢圓形的菌體呈短鏈狀的排列，可初步鑒定為豬鏈球菌。進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)氧氟沙星、頭孢噻呋鈉和環(huán)丙沙星等抗生素敏感，但對(duì)其他抗生素(如卡那霉素、頭孢拉定、頭孢唑林和羧芐西林等)存在不同程度的耐藥。

3.2 組織樣品核酸提取及病毒檢測(cè)

將組織樣品(主要為淋巴結(jié)和小腸)混合后剪碎，取約2.0 g樣品與10 mL滅菌PBS溶液混合、研磨，將混合樣品高速離心后取上清，用DNA與RNA核酸共提試劑盒提取上清核酸，同時(shí)用商業(yè)化試劑盒將部分核酸樣品中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)并合成可導(dǎo)致仔豬腹瀉的常見(jiàn)病原保守性引物，以樣品核酸為模板，通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)樣品中是否存在PEDV、豬傳染性胃腸炎(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)和德塔冠狀病毒(PDcoV)，以及豬偽狂犬病毒(PRV)、豬藍(lán)耳病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)二型病毒(PCV2)核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2頭發(fā)病仔豬組織樣品中均檢測(cè)出PEDV核酸，但其他檢測(cè)病原均為陰性。

由于目前我國(guó)流行的PEDV毒株包括疫苗株和變異株，為進(jìn)一步分析該場(chǎng)爆發(fā)的PEDV毒株基因型，擴(kuò)增了該毒株的S基因部分序列，并將該序列進(jìn)行測(cè)序與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株S基因部分序列與Genbnak收錄的國(guó)內(nèi)流行的PEDV變異株核苷酸序列高度同源，但與CV777等疫苗株同源性相對(duì)較低。

4 診斷結(jié)果

結(jié)合臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，最終可判定該場(chǎng)出現(xiàn)PEDV與豬鏈球菌混合感染，且PEDV毒株為變異株。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，PEDV是導(dǎo)致我國(guó)豬場(chǎng)仔豬腹瀉的主要腸道病原，導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原較多，且臨床及病理變化較為類似，這需要實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)(如PCR法和ELISA法等)對(duì)病原進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。同時(shí)我國(guó)流行的PEDV毒株可分為疫苗株和變異株，已有研究表明，現(xiàn)在市場(chǎng)上基于疫苗株研發(fā)的疫苗尚不能完全抵抗變異株對(duì)仔豬的感染，因此需要通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)確定豬場(chǎng)爆發(fā)PEDV毒株的基因型特征，從而具有針對(duì)性地選擇更加有效的疫苗進(jìn)行防控。

此外，由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致豬場(chǎng)出現(xiàn)耐藥性嚴(yán)重的細(xì)菌性病原較為常見(jiàn)，本案例中發(fā)生的豬鏈球菌株也對(duì)部分抗生素具有較強(qiáng)的耐藥性。對(duì)于此類細(xì)菌性病原的防控，可采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)對(duì)菌株分離后，采用藥敏試驗(yàn)分析菌株對(duì)哪些抗生素敏感，從而選擇有效的藥物進(jìn)行防治。