胡月清，王若仲，黃志剛，蕭浪濤

(1.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實驗室，江西 宜春 336000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，植物激素與生長發(fā)育湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410128)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛分布的一類轉(zhuǎn)錄因子，在不同植物脅迫抗性、發(fā)育和生理過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。該類轉(zhuǎn)錄因子具有1～2個60個氨基酸左右的保守WRKY結(jié)構(gòu)域，其N端包括一段WRKYGQK核心序列，結(jié)構(gòu)域的C端是一段類似鋅指的結(jié)構(gòu)CX4-5CX22-23HXH或CX7CX23HXC[4]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通過和靶基因啟動子上的順式作用元件W-box(TTGAC(C/T))結(jié)合，行使激活或者抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的功能[5-6]。

目前,已鑒定出的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)WRKY轉(zhuǎn)錄因子超過80個[7]，但相對于擬南芥和水稻，馬鈴薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的系統(tǒng)研究甚少。Dellagi等[8]利用抑制性差減雜交技術(shù)構(gòu)建了馬鈴薯cDNA文庫，獲得了編碼172個氨基酸的StWRKY基因，該基因在軟腐病菌侵染后表達(dá)上調(diào)，參與馬鈴薯對軟腐病的抵御過程。2004年從野生馬鈴薯胚珠中克隆獲得編碼525個氨基酸的ScWRKY基因，在受精16 d的魚雷期胚胎中瞬時高表達(dá)，在發(fā)育完全的根、莖、花粉、雄蕊、雌蕊中表達(dá)量偏低，表明ScWRKY可能參與胚胎形成過程[9]。有研究表明，StWRKY1參與抵抗馬鈴薯晚疫病和水分脅迫[10-11]，StWRKY8通過調(diào)控生物堿的合成提高馬鈴薯對晚疫病病原菌的侵染防御[12]。國內(nèi)學(xué)者克隆了WRKY2及WRKY6，發(fā)現(xiàn)它們分別對干旱和低鉀脅迫積極響應(yīng)[13-14]。馬鈴薯StWRKY57的克隆及功能未見報道。擬南芥同源轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY57可作為激活因子，通過增加脫落酸(ABA)的積累，上調(diào)干旱脅迫響應(yīng)基因RD29A、NCED3和ABA3的表達(dá)提高擬南芥的干旱抗性[15]。前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，StWRKY57的表達(dá)顯著受ABA誘導(dǎo)，相比野生型，過表達(dá)StWRKY57基因擬南芥植株表現(xiàn)出更高的干旱耐受性。因而，推測StWRKY57同樣正調(diào)控馬鈴薯的干旱脅迫響應(yīng)。

馬鈴薯是對水分虧缺非常敏感的作物，干旱脅迫是制約其產(chǎn)量及品質(zhì)的重要因素[16]。2015年中央一號文件明確提出，將馬鈴薯定位在繼水稻、小麥、玉米之外的第四大主糧作物。開展StWRKY57在干旱脅迫響應(yīng)中的功能研究對啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略及在逆境條件下保持馬鈴薯產(chǎn)量具有重要意義。因而，本研究克隆了馬鈴薯耐旱品種PB06的轉(zhuǎn)錄因子基因WRKY57-PB，并對其編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)和原核表達(dá)分析，以期為后續(xù)生物學(xué)功能和分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以馬鈴薯耐旱品種PB06為試驗材料。表達(dá)菌株Tuner、Rosetta、BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pGEX-KG均由植物激素與生長發(fā)育湖南省重點(diǎn)實驗室種植或保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、T克隆試劑盒pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit、高保真DNA聚合酶TransStart?FastPfuDNA Polymerase和Trans2K Plus DNA Marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SacⅠ購于TaKaRa(大連)公司；凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；蛋白Marker(PageRuler Prestained Protein Ladder)、anti-GST抗體、HRP標(biāo)記的鼠二抗購于引Thermo公司；引物合成及DNA測序由華大基因公司完成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 序列的獲得及基因克隆 通過在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/)查找開放閱讀框ORF，確定CDS區(qū)序列。設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物序列為：5′-GGATCCAT GGATGAGAACGATAAGCAGG-3′，引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ；下游引物序列為：5′-GAATTCTTATCTGCT TCGCATCCCAGGA-3′，引入酶切位點(diǎn)SacⅠ。

取0.2 mg左右馬鈴薯脫毒苗的莖段在液氮中研磨，加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA。用DNase Ⅰ去除gDNA污染后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。gDNA的去除和反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件及程序均按照寶生物工程(大連)有限公司的試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板擴(kuò)增StWRKY-PB基因，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃充分預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，34個循環(huán)后；72 ℃終延伸5 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收后，按照說明書進(jìn)行T克隆并測序獲得正確的基因CDS全長。

1.2.2StWRKY57-PB編碼蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 采用在線工具Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對StWRKY57-PB基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測；蛋白二級結(jié)構(gòu)與3D結(jié)構(gòu)建模分別采用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測；亞細(xì)胞定位采用在線軟件PSORT(http://www.genscript.com/tools/psort)預(yù)測。應(yīng)用結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART(http://smart.embl.de/)對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗證和功能注釋。采用ClustalW軟件對StWRKY57-PB與其他物種的同源WRKY蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對及作圖，采用MEGA 5.05軟件最大簡約法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切StWRKY57的T克隆載體以及pGEX-KG，分別回收StWRKY57-PB和pGEX-KG后，按T4DNA連接酶說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，采用熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并篩選到正確克隆。測序正確后，提取質(zhì)粒pGEX-KG∶∶WRKY57，電擊法分別轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)菌株Tuner、Rosetta、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得攜帶有目的基因的原核表達(dá)菌株。

1.2.4 GST融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化 將上述表達(dá)菌株菌液涂板，挑取單菌落，在含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)；取重組菌按 1∶100 的體積比接入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)4 h至 OD600為0.4～0.6 時，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前總蛋白樣，剩余菌液中加入終濃度為 0.5 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，25 ℃、180 r/min下誘導(dǎo)6 h，取1 mL菌液做全蛋白檢測。

將剩余菌液收集在離心管中，4 ℃，8 800 r/min 離心10 min，棄上清，用TBS裂解液(50 mmol/L HCl-Tris，150 mmol/L NaCl，pH值7.4)重懸并加入終溶度分別為1 mg/mL的溶菌酶和1 mmol/L的PMSF。冰上放置30 min，超聲波破碎30 min。8 800 r/min離心15 min，上清中加入500 μL GST SefiroseTMresin 樹脂，使用蛋白旋轉(zhuǎn)儀輕輕晃動吸附蛋白5～6 h，使GST-WRKY57與樹脂充分結(jié)合。2 300 r/min，3 min離心棄上清，加入4倍體積TBS洗脫液(50 mmol/L HCl-Tris，300 mmol/L NaCl，pH值7.4)，輕搖至beads懸浮于溶液中，2 300 r/min，3 min離心棄上清，重復(fù)2次。最后加入0.25 mL GST Elution Buffer(50 mmol/L HCl-Tris，300 mmol/L NaCl，40 mmol/L Reduced Glutathione pH值8.0)，輕搖2～3 h，洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 Western Blot檢測 將SDS-PAGE電泳后膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min，依據(jù)膠的大小剪取NC膜1片和濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min。將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，100 mA，轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，置膜于30 mL封閉緩沖液(含5%脫脂牛奶的TBS/T，Tween-20 的含量為0.05%)中室溫?fù)u動封閉1.5 h。按1∶5 000 的比例加入anti-GST一抗，室溫孵育2.5 h或 4 ℃過夜，緩慢搖動。用20 mL TBS/T 洗3 次后按1∶6 000 的比例加入辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠二抗，室溫孵育1 h后用TBS/T 洗3次，TBS洗1次，aZURE biosystems蛋白顯影檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StWRKY57-PB基因的克隆

通過同源比對擬南芥的WRKY57得到馬鈴薯同源蛋白的轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè)計了一對CDS區(qū)特異引物，以馬鈴薯PB06的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條長約1 000 bp的特異條帶(圖1-A)，T克隆后，用BamHⅠ、SacⅠ雙酶切T載體鑒定(圖1-B)，切出2條符合預(yù)期大小的條帶，一條為T載體大小約4 000 bp，另一條為目的基因CDS大小約1 000 bp，并將酶切鑒定后T載體送華大基因測序。測序結(jié)果表明，CDS區(qū)全長981 bp，A、T、G 和C 堿基含量分別為29.56%，25.59%，23.14%，21.71%。與NCBI公布的馬鈴薯預(yù)測WRKY57基因(XP_006348711.1，PGSC0003DMT400072958)CDS區(qū)序列堿基數(shù)目一致，均編碼326個氨基酸，但是有6個堿基的差異，其中2個堿基為無義突變，另外4個堿基突變導(dǎo)致氨基酸突變。4個突變的氨基酸分別是第84個氨基酸S-N，第112個氨基酸V-N，第114個氨基酸E-G，第289個氨基酸E-D，NCBI數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明，該序列屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族Ⅱc類成員，因與馬鈴薯數(shù)據(jù)庫及NCBI公布的WRKY57蛋白序列有4個氨基酸不一樣，將該蛋白基因命名為StWRKY57-PB。

2.2 馬鈴薯StWRKY57-PB基因編碼蛋白理化特性分析

在線軟件Protparam預(yù)測結(jié)果顯示，StWRKY57-PB編碼一個含有326個氨基酸的蛋白，其分子式為C1512H2339N441O515S10，分子質(zhì)量為35.3 ku，蛋白表現(xiàn)為偏酸，等電點(diǎn)pI為5.42，包含帶正電殘基(K、R)34個，帶負(fù)電殘基(D、E)44個。進(jìn)一步分析得到，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為54.20，說明WRKY57蛋白為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為45.49，說明其在不同環(huán)境中穩(wěn)定性較差；平均親水性系數(shù)為-0.865小于0，說明該蛋白屬于親水蛋白。WRKY57-PB二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明(圖2),不規(guī)則卷曲所占比例最大，為61.96%；α螺旋次之，比例為16.56%；延伸鏈的比率為13.50%；β轉(zhuǎn)角最少，僅為7.98%。WRKY57-PB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)模型如圖3所示。以擬南芥WRKY1(2ayd.1.A)三維結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建StWRKY57-PB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)75個氨基酸殘基(占整個蛋白的23%)與對照模型具有57.33%的相似度。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，細(xì)胞核定位系數(shù)69.6%，線粒體定位系數(shù)13.0%、細(xì)胞質(zhì)定位系數(shù)13.0%，過氧化物酶定位系數(shù)為4.3%，定位在細(xì)胞核的可信為94.1%，所以該蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核。

2.3 馬鈴薯StWRKY57-PB蛋白序列比對及聚類分析

將WRKY57-PB蛋白序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似性搜索。從非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中下載與WRKY57-PB同源的12條序列，利用ClustalW軟件，將WRKY57-PB蛋白序列與下載得到的蛋白序列進(jìn)行氨基酸同源比對，發(fā)現(xiàn)相似度為馬鈴薯(SolanumtuberosumXP_006348711.1)99%，番茄(SolanumlycopersicumXP_004239067.1)93%，絨毛煙草(NicotianatomentosiformisXP_009610329.1)77%，辣椒(CapsicumannuumXP_016547995.1)70%，胡桃(JuglansregiaXP_018808597.1)66%，中?？Х?CoffeacanephoraCDP00413.1)65%，牽牛花(IpomoeanilXP_019166374.1)59%，葡萄(VitisviniferaXP_002274549.1)58%，可可(TheobromacacaoEOY01748.1)58%，棗(ZiziphusjujubaXP_015894978.1)56%，中棉(GossypiumarboreumXP_017636878.1)56%，擬南芥(ArabidopsisthalianaOAP14911.1)57%。利用ClustalW軟件，將WRKY57-PB蛋白序列與下載得到的12條蛋白序進(jìn)行氨基酸同源比對，證實上述蛋白序列具有不同的序列相似度(圖4)。為進(jìn)一步分析WRKY蛋白在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 5.05軟件，采用最大簡約法構(gòu)建了不同植物物種間WRKY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯WRKY57-PB與番茄及馬鈴薯測序品種WRKY57聚在一起，分子距離最近，其次與辣椒、絨毛煙草的分子距離也相對較近，與擬南芥的分子距離最遠(yuǎn)(圖5)。

2.4 StWRKY57-PB原核表達(dá)載體的鑒定、蛋白表達(dá)與純化

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定pGEX-KG∶∶WRKY57-PB重組質(zhì)粒，酶切片段大小符合預(yù)期設(shè)想(圖1-C)。將酶切陽性的重組質(zhì)粒送華大基因公司測序，基因序列正確無誤，可用做后續(xù)原核蛋白的表達(dá)。

鑒于溫度越高蛋白活性越低，而溫度低于16 ℃又會導(dǎo)致細(xì)菌生長緩慢，降低蛋白總產(chǎn)量，故選擇25 ℃作為誘導(dǎo)溫度。根據(jù)其他報道的原核蛋白表達(dá)條件[17-18]，誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前后全蛋白表達(dá)量差異非常明顯，WRKY57-PB在3個不同菌株(BL21、Rosetta、Tuner)中都能高效表達(dá)，且不同菌株中表達(dá)量差異不大。融合蛋白在3個不同菌株中上清樣的表達(dá)量均大于沉淀樣蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE顯示，上清樣純化后融合蛋白約為70 ku(圖6)，條帶特異性好，與未純化蛋白條帶大小也相一致。值得提出的是，GST相對質(zhì)量約26 ku，WRKY57-PB相對質(zhì)量預(yù)測約36 ku，因此，GST與WRKY57融合蛋白約為62 ku，但電泳檢測蛋白GST-StWRKY57-PB融合蛋白電泳檢測大小在70 ku左右，與預(yù)測大小略有差異。

2.5 Western Blot檢測

為了進(jìn)一步驗證蛋白的表達(dá)和純化融合蛋白的準(zhǔn)確性，用抗GST標(biāo)簽的抗體進(jìn)行了免疫印跡檢測 (圖7)，結(jié)果顯示，3個不同菌株BL21、Rosetta、Tuner中規(guī)律一致，未經(jīng)誘導(dǎo)的對照中信號非常弱，而在誘導(dǎo)后的全蛋白和純化蛋白質(zhì)樣品中均出現(xiàn)特異信號，尤其是在全蛋白中信號非常強(qiáng)。Western Blot檢測結(jié)果與SDS-PAGE檢測相一致，說明獲得了表達(dá)純化的StWRKY57-PB蛋白質(zhì)。

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各類群植物中，表明WRKY蛋白履行重要的生物功能。報道表明，它們的確參與植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)及多個生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，比如糖代謝、逆境脅迫、種子的休眠和萌發(fā)、葉片的衰老、毛狀體和胚的發(fā)育等[19-21]。相對于模式植物擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，馬鈴薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能報道較少。本研究采取同源克隆的方法克隆了馬鈴薯一個耐旱品種PB06的StWRKY57基因。根據(jù)序列分析，發(fā)現(xiàn)其與馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫中公布的序列有6個堿基的差異，并且有4個氨基酸的翻譯發(fā)生了變化，暗示在不同的品種間WRKY57轉(zhuǎn)錄因子具有變異性，這種變異可能與其特殊的生理生化性狀相關(guān)，如可能與抗旱特性相關(guān)。今后的研究中可克隆幾個抗旱性不同馬鈴薯品種的WRKY57序列并比它們的差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該蛋白與同屬植物番茄的同源性較高93%，而不同屬間、不同科間的同源性較低，與擬南芥的相似性有57%，這與其他學(xué)者的研究一致[22]。為了進(jìn)一步開展StWRKY57-PB基因功能研究，對其編碼蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，GST-WRKY57相對質(zhì)量約為62 ku，但電泳檢測顯示大小為70 ku，這可能是因為蛋白修飾造成不同折疊構(gòu)象導(dǎo)致，水稻W(wǎng)RKY42蛋白表達(dá)亦有類似的情況[23]。

根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)的特征，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3組[4，24]，第1組含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，且其鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)；第2組含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)與第一組相同，依據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似性，可進(jìn)一步將其劃分為5個亞組：IIa、IIb、IIc、IId和IIe；第3組含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域且鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC類型(C-X7-C-X23-H-X1-C)。擬南芥的72個WRKY家族成員中有32個屬于第1組，26個屬于第2組，14個屬于第3組[25]。馬鈴薯的81個WRKY轉(zhuǎn)錄因子成員，其中13個屬于第1組，53個屬于第2組(IIa 6個、IIb 5個、IIc 16個、IId 7個、IIe 19個)，15個屬于第3組[7]。本研究克隆得到的StWRKY57-PB屬于IIc類，在馬鈴薯中是首次克隆，目前，未見茄科作物中有該同源基因功能的報道。

馬鈴薯作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它的產(chǎn)量和質(zhì)量是關(guān)乎民生的重要問題。提高其產(chǎn)量和質(zhì)量的重要措施是提高品種的抗逆能力，很可惜，目前關(guān)于馬鈴薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與逆境脅迫的報道并不多見。AtWRKY57通過調(diào)控植物激素ABA的代謝及逆境脅迫響應(yīng)基因表達(dá)發(fā)揮抗旱功能；前期試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)StWRKY57-PB基因的擬南芥顯著提高了干旱耐受性，因而筆者預(yù)測該同源轉(zhuǎn)錄因子StWRKY57在馬鈴薯抗逆中可能具有重要功能。本研究克隆了StWRKY57-PB的完整編碼框，并成功在大腸桿菌中表達(dá)并純化出特異性高的融合蛋白，下一步的工作可以驗證其是否具有W 盒的結(jié)合能力，構(gòu)建基因表達(dá)譜、運(yùn)用遺傳轉(zhuǎn)化的方法鑒定其生物學(xué)功能以及采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)尋找轉(zhuǎn)錄因子靶基因揭示其響應(yīng)干旱脅迫的作用機(jī)制。