李曉宇，王會倩，朱保偉，趙 明，謝則平，張淑敏

(1.煙臺賽澤生物技術(shù)有限公司，山東 煙臺 264670；2.山東國際生物科技園發(fā)展有限公司，山東 煙臺 264670；3.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

隨著間充質(zhì)干細胞(MSCs)基礎(chǔ)研究的深入，其臨床適應(yīng)癥涵蓋了慢性病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液病等。然而阻礙干細胞臨床有效性的關(guān)鍵在于干細胞移植后出現(xiàn)的細胞存活率偏低，整合及歸巢效果不良，細胞分化率低，體內(nèi)存活時間較短以及免疫調(diào)節(jié)能力不足等。因而，解決MSCs移植成功率的問題成為干細胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。文章結(jié)合目前MSCs基礎(chǔ)及臨床研究的熱點，綜述了MSCs與藥物、細胞因子、材料支架、物理因素等方法聯(lián)合應(yīng)用并輔以適合的輸入方式和劑量，以提高MSCs移植有效性，為后續(xù)MSCs臨床研究方案的制定提供了參考依據(jù)。

1 MSCs應(yīng)用概述

MSCs具有很強的自我更新能力和多向分化潛能，可來源于骨髓、臍帶、臍帶血、胎盤、脂肪等。其中骨髓來源MSCs發(fā)現(xiàn)最早且研究的最為深入，而臍帶血來源的MSCs由于其易于獲得，應(yīng)用也越來越廣泛[1]。目前具有潛力的MSCs是脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)，因為脂肪來源廣泛且易獲取[2]。有研究比較了來自7種不同來源的MSCs在成骨方面的應(yīng)用，結(jié)論是ADSCs和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)同樣具有顯著效果[3]。

MSCs是繼造血干細胞之后又一類廣泛開展臨床試驗的干細胞。通過美國NIH(National Institutes of Health)下屬的ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，截止到2020年8月底，全球關(guān)于MSCs臨床研究項目超過9 000余項。然而由于MSCs移植后較差的細胞存活率，加之移植后在靶向組織中檢出率低、分化效率差以及體內(nèi)存活時間短等問題[4-6]，會直接影響MSCs治療效果。因此，如何提高MSCs臨床治療效果成為一個重要的研究方向。

2 MSCs聯(lián)合應(yīng)用提高移植有效性

文章總結(jié)了通過預(yù)處理MSCs或者將MSCs與生物材料/分子共同植入，人為創(chuàng)造MSCs微環(huán)境，可以誘導(dǎo)細胞增殖、定向分化，從而提高細胞存活率、改善歸巢效應(yīng)、延長細胞作用時間、增強機體免疫調(diào)節(jié)能力等，提高MSCs移植效率。

2.1與藥物聯(lián)合應(yīng)用：MSCs與藥物共同使用或者通過藥物預(yù)處理MSCs，可以改善輸入環(huán)境，觸發(fā)相關(guān)信號通路等，從而增強MSCs移植效率。研究發(fā)現(xiàn)，在實驗性結(jié)腸炎小鼠模型中，肝素與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)聯(lián)合應(yīng)用可以有效增強BMSC的治療效果，是因為肝素(400 U / kg)進行抗凝治療可減少BMSC肺栓塞以及BMSC肺部清除率，從而提高細胞存活率，并增強BMSC在細胞治療中向靶器官的遷移和維持，提高干細胞治療效果[7]。研究表明，地西他濱藥物可激活I(lǐng)L4R / STAT6 / STAT3 /PPARγ信號通路，從而調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSC)與地西他濱聯(lián)合使用可以減少炎癥反應(yīng)，提高胰島素敏感性，較單純UC-MSC治療可起到長期降糖的作用[8]。某些相關(guān)化合物的添加還可以激發(fā)信號通路，促進細胞遷移相關(guān)物質(zhì)的表達[9]。鐵螯合劑去鐵胺預(yù)處理BMSCs可以通過增加缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白的穩(wěn)定性，從而影響某些趨化因子受體以及所涉及的蛋白酶來增加BMSCs的歸巢效應(yīng)，最終改善MSCs治療效果[10]。

2.2細胞因子預(yù)處理：細胞因子作為一種信號分子在MSCs增殖分化過程中起著至關(guān)重要的作用。細胞因子按生物學(xué)活性不同主要分為以下幾類：白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、造血生長因子(HGF)、集落刺激因子(CSF)等[11]。由細胞因子信號引起的具體細胞反應(yīng)會引導(dǎo)一系列細胞行為，包括影響細胞的生存、促進細胞增殖和分化、影響細胞遷移等。除此之外，還具有明顯的免疫調(diào)控能力。而MSCs免疫調(diào)控能力的激活需要一定的組織微環(huán)境。細胞因子預(yù)處理MSCs不僅可以提高干細胞的增殖能力和分化潛能，還可以調(diào)節(jié)MSCs發(fā)揮免疫抑制或增強的作用、改善體內(nèi)微環(huán)境等，從而優(yōu)化MSCs治療效果。

研究發(fā)現(xiàn)，含有堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子培養(yǎng)的毛囊來源的間充質(zhì)干細胞(HF-MSC)，可以極大提高HF-MSC高增值和多分化的潛能[12]。肥大細胞顆粒預(yù)處理hUCB-MSC可以使組胺介導(dǎo)COX-2信號通路上調(diào)，從而調(diào)節(jié)變態(tài)免疫反應(yīng)，提高hUCB-MSC對特應(yīng)性皮炎的治療效果[13]。白介素-1β和干擾素-γ預(yù)處理人臍帶血間充質(zhì)干細胞(hUCB-MSC)可通過增強前列腺素E2的分泌和吲哚胺2,3-雙加氧酶活性，增強hUCB-MSC免疫調(diào)節(jié)能力，在硫酸葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中較單獨hUCB-MSC 治療效果更佳[14]。

目前，細胞因子的使用不再僅僅是直接溶于培養(yǎng)基中，更多的是通過化學(xué)的方法使其綁定到細胞基質(zhì)以及支架材料上，或者通過物理方法將其封裝，定點釋放生物活性因子。其中物理方法應(yīng)用更為廣泛，因為他不需要有能與細胞因子共價結(jié)合的位點[15]。

2.3MSCs與支架材料的復(fù)合使用：MSCs的歸巢效應(yīng)主要是通過干細胞表面與目標物的受體或配體結(jié)合來驅(qū)動的[16]。一些生物相容性好的支架材料的作用不僅能夠起到結(jié)構(gòu)支持的作用，還能提供精確的物理或化學(xué)信號進行細胞的信號交流實現(xiàn)干細胞的歸巢，促進干細胞與宿主組織的整合。除此之外，MSCs還具有誘導(dǎo)分化的作用，并且可以通過傳遞基因或藥物延長細胞存活時間提高多種疾病的干細胞治療效果[17]。目前，支架材料在細胞再生及組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其中最具前景的組織再生方式就是利用支架材料在受損部位控制趨化因子的方向，并延長趨化因子對干細胞歸巢效應(yīng)的時間，從而促進組織的再生。

MSCs與支架材料在各個組織修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在神經(jīng)損傷修復(fù)方面，人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSC)和含有成纖維細胞生長因子(FGF-2)的納米球材料共同移植，可以增加hBMSC增殖及其細胞存活率，并顯著提高脊髓損傷大鼠模型的治療效果[18]。在軟組織修復(fù)方面，將脂肪來源的MSCs 移植于藻酸鹽支架上，可以提高MSCs分化為脂肪細胞的效率，并顯示出血管生成活性，從而用于字體軟組織修復(fù)[19]。在創(chuàng)傷修復(fù)方面，hUCB-MSC與膠原纖維蛋白雙層膜結(jié)合對小鼠傷口愈合的實驗中可以加速傷口的愈合[20]。在成骨方面，將hUCB-MSC與多孔絲素蛋白(SF)/殼聚糖(CS)支架[21]或仿生礦化膠原蛋白支架[22]聯(lián)合使用，其增殖能力、成軟骨分化能力、歸巢能力明顯提高，促進體內(nèi)骨缺損的修復(fù)速度；含重組人類轉(zhuǎn)化生長因子-β3(rhTGF-β3)的核-殼納米纖維支架可以促進人臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞(WMSCs)的成軟骨分化能力，從而提高WMSCs在組織工程化氣管軟骨構(gòu)建中的應(yīng)用[23]。由此可見，支架材料與干細胞聯(lián)合應(yīng)用在神經(jīng)損傷修復(fù)、軟組織修復(fù)、創(chuàng)傷修復(fù)、骨損傷修復(fù)等方面顯示出突出效果。

2.4物理因素預(yù)處理：物理因素預(yù)處理MSCs主要是指低氧預(yù)處理以及沖擊波療法(ESWT)。眾多研究人員將常氧(21% O2)與低氧(1% O2)培養(yǎng)環(huán)境進行對照研究，表明，低氧預(yù)處理可以顯著影響干細胞的旁分泌功能[24]，從而促進作用細胞的增殖、遷移和小管形成等作用[25]。此外，低氧預(yù)處理可能誘導(dǎo)參與細胞遷移的一些基因表達，并且可以改善細胞的存活、增殖和治療潛力[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)處理MSCs在體外可以提高細胞存活率以及促血管生成因子的表達，在治療食蟹猴心力衰竭時，實驗組較對照組心肌梗死情況及心室功能恢復(fù)更好，并能延長干細胞治療作用[28]。

沖擊波(ESW)作為一種物理因子，具有不良反應(yīng)小、無創(chuàng)、操作簡便等優(yōu)點。ESW是利用液電轉(zhuǎn)化和傳遞的原理，在不同密度組織之間產(chǎn)生能量梯度差及扭拉力，來實現(xiàn)治療的目的[29]。研究表明，ESW可以誘導(dǎo)MSCs增殖分化，其分化電壓多為5kV或8.5kV，頻率多為1.7Hz或2Hz[30]。在細胞增殖方面，使用總劑量為2 000次的中高能量作用3～8 d，可使培養(yǎng)的細胞數(shù)量明顯增多。研究發(fā)現(xiàn)，ESW與自體脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)聯(lián)合應(yīng)用，較單獨ESW及ADMSCs治療，能夠增加了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-4的表達，可以顯著提高ADMSCs的增殖分化，在早期膝骨關(guān)節(jié)炎的治療中具有協(xié)同促進作用[31]。在雄性小豬急性心肌梗塞模型中，將ESWT和骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)聯(lián)合應(yīng)用，在改善左心室功能障礙方面優(yōu)于單獨的BM-MSC治療[32]。

3 MSCs輸入方式及劑量對移植有效性的影響

在任何新型治療劑開發(fā)過程中的重要階段是確認最佳劑量和給藥途徑，同理，影響MSCs治療效果的因素也包括細胞輸入方式以及輸入劑量。關(guān)于輸入方式，MSCs的大多數(shù)研究都采用靜脈輸入[33-34]，臨床上普遍認為靜脈輸入是安全的，輸入后發(fā)熱是唯一可能發(fā)生的不良反應(yīng)[35]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠靜脈輸入MSCs后會在肺部蓄積再遷移到血管外，其中一半以上滯留肺部的MSCs會被組織巨噬細胞迅速吞噬[36]，移植效率也會因此而降低。除了靜脈輸入外，在許多多發(fā)性硬化癥的研究中是采用鞘內(nèi)注射來進行的[37-38]。除此之外還可針對患處進行定點注射，例如對關(guān)節(jié)炎患者進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射人脂肪間充質(zhì)干細胞[39]，對心臟病患者通過冠狀動脈[40]輸入及心內(nèi)膜注射[41]的途徑等都可以達到治療的效果。

眾多研究表明，MSCs細胞移植劑量并非越多越好[42]，其劑量高低可以影響干細胞增殖、分化并引起宿主體內(nèi)微環(huán)境變化、表達譜差異等。普遍來講，向嚙齒動物體內(nèi)靜脈輸注MSCs時，其劑量通常為5×107個細胞/kg，人體中MSCs的輸入劑量通常為1×106-2×106個細胞/kg，不超過1.2×107個細胞/kg[43]。關(guān)于定點注射，輸入量因病種不同而產(chǎn)生差異。在一項人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(haMSCs)治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床試驗中，關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射低劑量(1×107)、中劑量(2×107)、高劑量(5×107)的haMSCs，結(jié)果顯示高劑量組治療效果更好[39]。然而該項研究除了證明關(guān)節(jié)內(nèi)注射haMSCs具有安全性和有效性之外，由于研究的樣本量較少，偏差較大，因此也存在一定的局限性。而另一項研究發(fā)現(xiàn)，向心肌梗塞的豬模型心內(nèi)膜輸注低劑量(2.4×107)、中劑量(2.4×108)、高劑量(4.4×108)的MSCs，結(jié)果顯示梗死面積顯著減少，但是治療效果與輸入劑量的高低沒有相關(guān)性[44]。綜上所述，MSCs的輸入方式及輸入量在細胞治療領(lǐng)域缺乏一致可靠的數(shù)據(jù)，在進行關(guān)鍵臨床試驗之前可能需要進行其他臨床前研究或小樣本量研究。

4 總結(jié)與展望

MSCs在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，合理選擇治療方案可以提高MSCs臨床有效性。通過MSCs與藥物、細胞因子、支架材料、物理方法等聯(lián)合應(yīng)用，并選擇合理輸入方式及劑量等，改善移植宿主的微環(huán)境，激發(fā)細胞遷移相關(guān)信號通路，提高移植細胞的存活率及分化效率，整合歸巢，作用時間及免疫調(diào)節(jié)能力等，可以極大提高MSCs移植效率。目前干細胞應(yīng)用逐漸由動物實驗慢慢向臨床轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過程中仍需不斷改善干細胞培養(yǎng)方式，盡可能減少移植后并發(fā)癥的問題以及干細胞來源的倫理問題等，以期用最簡便、高效、微創(chuàng)的方式解決復(fù)雜的組織再生問題。在未來MSCs治療中應(yīng)當更傾向于患者個性化治療，為不同個體、不同階段的患者選擇合適的MSCs類型和最佳應(yīng)用方案[45]。