郭晶晶 牟迪 韓穎

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的85%[1]。臨床上，多數(shù)NSCLC診斷時(shí)已為晚期。但是，隨著免疫治療的進(jìn)展，多種免疫檢查點(diǎn)［如程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1, PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4,CTLA-4）］抑制劑通過增強(qiáng)患者自身免疫系統(tǒng)的功能，直接或間接地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是PD-1/細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）抗體目前被認(rèn)為是NSCLC治療的支柱。Nivolumab是免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）中第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療肺癌的藥物，Pembrolizumab作為獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)的第一批PD-1抑制劑，二者均顯著提高了晚期NSCLC患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS），同時(shí)改善了患者的生活質(zhì)量。盡管在免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法中觀察到持久的緩解率，但大多數(shù)患者未能從治療中獲益，腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間不斷的相互作用，使得腫瘤細(xì)胞通過免疫消除、相持和逃逸三個(gè)連續(xù)階段而逃避免疫監(jiān)視，發(fā)生原發(fā)性耐藥、適應(yīng)性耐藥和獲得性耐藥[2,3]。T細(xì)胞是介導(dǎo)免疫耐受的主要細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞的功能可以更好地抑制腫瘤的生長和增殖。腫瘤免疫治療激活腫瘤內(nèi)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）的活性，協(xié)助激活淋巴器官中的腫瘤特異性CTL，建立持久有效的抗腫瘤免疫[4]。通過對(duì)腫瘤患者T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，可以改善免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床效果[5,6]。相反，腫瘤特異性T細(xì)胞的功能障礙導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]，腫瘤浸潤性T細(xì)胞數(shù)量下降的患者預(yù)后較差[8]。因此，如何重新激活T細(xì)胞的免疫功能、逆轉(zhuǎn)PD-1/PD-L1抗體的耐藥、提高免疫治療的療效仍是當(dāng)今治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。最新研究[9]發(fā)現(xiàn)，Cereblon與CMs（如沙利度胺和CC-885）結(jié)合通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生長、增殖與代謝，上調(diào)T細(xì)胞的免疫功能，從而逆轉(zhuǎn)PD-1抗體的耐藥。本文就T細(xì)胞的下調(diào)導(dǎo)致PD-1抗體治療肺癌耐藥的機(jī)制、CRBN調(diào)節(jié)T細(xì)胞的機(jī)制及CRBN調(diào)節(jié)劑治療肺癌的研究進(jìn)展進(jìn)行論述。

1 T細(xì)胞的下調(diào)導(dǎo)致PD-1抗體治療肺癌耐藥的機(jī)制

1.1 細(xì)胞產(chǎn)物下調(diào)了T細(xì)胞的生長增殖與活化 在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤浸潤性T細(xì)胞會(huì)因慢性抗原刺激和炎性腫瘤微環(huán)境而衰竭。此外，腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，如吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenases,IDOs）、外泌體和白介素6（interleukin 6, IL-6）等 抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能[10]。

IDOs是參與色氨酸分解代謝的限速酶，在腫瘤微環(huán)境中具有免疫抑制功能[11,12]。IDO將色氨酸氧化為犬尿氨酸，而色氨酸是T細(xì)胞活化的必需氨基酸，犬尿氨酸則會(huì)抑制T細(xì)胞的活化。該反應(yīng)形成了一個(gè)以效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞減少為特征的高敏微環(huán)境，并導(dǎo)致Tregs和髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）數(shù)量增加[11,13]。此外，腫瘤細(xì)胞分泌的IL-6可以激活MDSCs，進(jìn)而使IDO發(fā)揮作用，進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的活化[14-16]。

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體也有類似的功能。外泌體通常為球形，由薄膜包裹，大小為30 nm-100 nm，表面攜帶有生物活性的PD-L1，可以抑制免疫應(yīng)答[17]。為了研究外泌體PD-L1的生物學(xué)功能，將PD-L1轉(zhuǎn)到低表達(dá)或無表達(dá)的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)外泌體PD-L1顯著抑制CD3/CD28-誘導(dǎo)的ERK的磷酸化和核因子κB激活T細(xì)胞[18,19]。Tregs外泌體miRNA通過抑制環(huán)氧合酶-2介導(dǎo)的干擾素4（interferon 4, IFN-4）通路，強(qiáng)烈抑制Th1細(xì)胞活性[20,21]。此外，外泌體PD-L1還可以通過抑制T細(xì)胞顆粒酶B的分泌，促進(jìn)腫瘤的生長[18]。腫瘤干細(xì)胞上的CD80通過與T細(xì)胞表面的CTLA-4結(jié)合，不僅抑制了T細(xì)胞的活性還降低了T細(xì)胞的增殖[22,23]。

1.2 細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能 腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子可以消除抗腫瘤免疫，提高腫瘤細(xì)胞存活率[24]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）不僅是促進(jìn)腫瘤的生長、生存、擴(kuò)散及血管生成[25-27]的重要因子，也是PD-L1觸發(fā)腫瘤細(xì)胞免疫抑制的主要因素。由核因子κB p65誘導(dǎo)的COP9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體5（COP9 signalosome 5, CSN5）對(duì)TNF-α介導(dǎo)PD-L1穩(wěn)定癌細(xì)胞及抑制PD-L1的泛素化和降解，極其重要[24,28]。PD-L1抑制IFN-γ的分泌，并通過減少細(xì)胞因子、誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的凋亡和限制T細(xì)胞進(jìn)入非淋巴組織而損害免疫功能[10,29,30]。腫瘤浸潤T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IFN-γ和JAK-3突變可進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)PD-L1表達(dá)，促進(jìn)適應(yīng)性抵抗和免疫抑制[2,10]。

IL-6是一種強(qiáng)效炎癥細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化和激活，在多種細(xì)胞中表現(xiàn)出功能多效性。在某些類型的腫瘤中，IL-6通過IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路向腫瘤細(xì)胞發(fā)送信號(hào)，并重塑局部微環(huán)境來支持原發(fā)腫瘤的生長、生存和侵襲。STAT3在腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中過度激活，不僅對(duì)中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，還可以正向調(diào)節(jié)Tregs和MDSCs抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[31-34]。在肺腺癌和胃癌患者中觀察到高IL-6的表達(dá)與患者生存情況呈負(fù)相關(guān)[35]。IL-10可抑制T細(xì)胞功能，促進(jìn)T細(xì)胞向Tregs的轉(zhuǎn)化，從而減弱T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)[36]。IL-22在肺癌細(xì)胞與免疫環(huán)境相互作用中起調(diào)節(jié)作用。通過酶聯(lián)免疫吸附法分析了195例支氣管鏡灌洗標(biāo)本IL-22的含量，發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中IL-22的濃度較高[37]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的重要因子，抑制免疫系統(tǒng)許多成分的功能。TGF-β信號(hào)不僅是炎癥性疾病的基礎(chǔ)，還促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β是免疫抑制的核心，通過破壞DCs功能和招募MDSC、Tregs等免疫抑制細(xì)胞，抑制淋巴結(jié)中腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)及浸潤[38-40]。TGF-β信號(hào)不僅能夠?qū)е潞途S持T細(xì)胞耐受，還可以抑制外周CD8+T細(xì)胞在外源性刺激下的擴(kuò)增和活性[39-41]。效應(yīng)Treg細(xì)胞表達(dá)大量的整合素αvβ8，激活潛伏期TGF-β和腫瘤源性TGF-β。反過來，TGF-β又能夠誘導(dǎo)FoxP3表達(dá)及Treg細(xì)胞的生成[42]。

此外，腫瘤細(xì)胞通過抗原調(diào)節(jié)和免疫檢查點(diǎn)分子相互作用而抑制免疫作用，抗腫瘤T細(xì)胞生成不足、腫瘤特異性T細(xì)胞功能不足及T細(xì)胞記憶形成受損等機(jī)制均可以導(dǎo)致腫瘤免疫逃避[43-45]，且內(nèi)源性T細(xì)胞需要通過抗原刺激及細(xì)胞因子介導(dǎo)識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞?？梢?，克服T細(xì)胞的下調(diào)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療極其重要[46]。

2 CRBN調(diào)節(jié)T細(xì)胞的機(jī)制

CRBN是一種結(jié)合蛋白，廣泛表達(dá)于前列腺、肝臟、胰腺、胎盤、腎臟、肺、外周血白細(xì)胞和大腦的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和外周膜中[47-51]。人類CRBN基因位于3號(hào)染色體3p26.2處，由1,329個(gè)堿基對(duì)組成，其中包含11個(gè)預(yù)測外顯子，其中外顯子5-7和10-11分別是DNA損傷結(jié)合蛋白1（DNA damage-binding protein 1, DDB1）和沙利度胺類免疫調(diào)節(jié)藥物的結(jié)合位點(diǎn)[52-55]。CRBN最初被認(rèn)為是常染色體中導(dǎo)致隱性輕度智力障礙基因[53]，且與DDB1相互作用致畸。有研究[56]發(fā)現(xiàn)，CRBN在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管形成、T細(xì)胞和NK細(xì)胞免疫活性、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)中發(fā)揮重要作用。

2.1 CRBN調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的增殖和激活 CRBN缺乏的情況下，T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）信號(hào)相關(guān)的基因受到了影響，因此CRBN表達(dá)的差異可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)TCR刺激的敏感性[51]。在同基因B16黑色素瘤移植研究中，Crbn-/-小鼠比Crbn+/+小鼠的腫瘤進(jìn)展和腫瘤負(fù)荷明顯減少，且增加了CD44+黑素瘤抗原酪氨酸相關(guān)蛋白（tyrosinase-related protein, Trp-2）反應(yīng)性CD8+腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞數(shù)量，表現(xiàn)出更好的抗腫瘤活性。通過定量RTPCR和免疫印跡分析表明，CRBN蛋白和mRNA在TCR活化后立即下降[9]。

CRBN通過影響活化T細(xì)胞的細(xì)胞核因子激活信號(hào)通路及表觀遺傳調(diào)控Kv1.3的表達(dá)來限制CD4+T細(xì)胞的激活[51]。CRBN作為T細(xì)胞激活的重要拮抗劑，通過c端yippe-mis18基序與Kcna3基因（編碼Kv1.3鉀離子通道、T細(xì)胞鈣內(nèi)流，參與記憶T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)）位點(diǎn)附近的3’保守區(qū)結(jié)合抑制T細(xì)胞的激活[9,51,57]。而在CRBN缺失的情況下，CD4+T細(xì)胞在T細(xì)胞受體刺激下表現(xiàn)出活性增強(qiáng)及IL-2產(chǎn)生增加，最終導(dǎo)致鉀通量和鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，使得CD4+T細(xì)胞過度活化。而過表達(dá)CRBN在T細(xì)胞中顯著降低了Kv1.3 mRNA的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的活性。研究[51]表明，T細(xì)胞特異性CRBN缺陷型小鼠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎可因Kv1.3引起的T細(xì)胞活化增加而加重。

2.2 CRBN調(diào)節(jié)T細(xì)胞的代謝與功能 CRBN缺失或CRBN E3連接酶調(diào)節(jié)化合物引發(fā)高代謝效應(yīng)T細(xì)胞表型，Crbn-/-CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出超激活狀態(tài)。抗CD3ε+抗CD28激活的Crbn-/-CD8+T細(xì)胞比活化的Crbn+/+CD8+T細(xì)胞有更高的葡萄糖攝取、己糖激酶活性和NAD+/NADH比值，即增強(qiáng)了葡萄糖攝取率、基礎(chǔ)糖酵解和呼吸速率。小鼠CD8+T的Crbn細(xì)胞缺乏時(shí)，其中樞代謝表現(xiàn)為生物能量的升高，葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的超生理水平以及代謝酶的表達(dá)增加[9,51]。

小鼠CRBN缺乏時(shí)，使得CD4+T細(xì)胞分化為Th17效應(yīng)細(xì)胞且IL-2產(chǎn)生增加[9,51]。在Crbn-/-CD8+T細(xì)胞與卵蛋白多肽TCR轉(zhuǎn)基因小鼠（OT1）雜交的細(xì)胞對(duì)H-2Kb卵清蛋白四聚體免疫親和力實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Crbn-/-CD8+T細(xì)胞立即對(duì)高、中親和力性多肽表達(dá)相當(dāng)水平的CD69，但CD69在OT1表達(dá)時(shí)間更長。與低親和力的多肽相比，高、中親和力多肽促進(jìn)OT1、Crbn-/-CD8+T細(xì)胞的增殖。因此，CRBN控制抗原刺激后活化的T細(xì)胞的持續(xù)存在，但不會(huì)對(duì)低親和力和無關(guān)抗原作出反應(yīng)[9]。

3 CRBN調(diào)節(jié)劑治療肺癌的研究進(jìn)展

CRBN作為E3泛素連接酶復(fù)合物CRL4CRBN的底物受體，與來那度胺和波馬那度胺等亞胺類免疫調(diào)節(jié)藥物的靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)，促進(jìn)底物Ikaros和Aiolos招募到E3復(fù)合物中，從而導(dǎo)致底物泛素化和降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生長增殖，逆轉(zhuǎn)PD-1抗體治療肺癌的耐藥[58-61]。而Ikaros和Aiolos是T細(xì)胞中IL-2表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[62-64]。如CRBN與CC-122結(jié)合，降解Aiolos和Ikaros，使得T細(xì)胞共刺激能力增強(qiáng)[60]。因此，調(diào)節(jié)CRBN的表達(dá)可增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞功能，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。多種CRBN調(diào)節(jié)劑現(xiàn)已用于臨床，如一代藥物沙利度胺和二代藥物來那度胺等。沙利度胺等亞胺類藥物可抑制TNF-α、IL-6和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的生成，誘導(dǎo)IL-2介導(dǎo)的初級(jí)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)IFN的表達(dá)，刺激T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性活性，從而增加T細(xì)胞的抗癌活性[65]。此外，不斷有新型CRBN調(diào)節(jié)劑用于臨床試驗(yàn)，如CC-885通過誘導(dǎo)CRBN和p97依賴的Polo樣激酶1泛素化和降解，從而增強(qiáng)NSCLC對(duì)Volasertib的敏感性，與Volasertib協(xié)同抑制肺癌[66,67]。

3.1 沙利度胺 有研究[51,58]認(rèn)為，當(dāng)沙利度胺與CRBN結(jié)合時(shí)，抑制E3泛素連接酶復(fù)合物的形成，進(jìn)而降低泛素連接酶的活性，導(dǎo)致四肢發(fā)育缺陷。最近的研究[51]表明，亞胺類免疫調(diào)節(jié)藥物通過與CRBN結(jié)合時(shí)，改變了底物泛素化，刺激T細(xì)胞中IL-2的產(chǎn)生。沙利度胺與CRBN的C端結(jié)合，可以阻止CRBN與Kcna3（編碼T細(xì)胞鈣內(nèi)流所需的Kv1.3鉀離子通道）的結(jié)合，特異性地改變了Kcna3基因座的表觀遺傳修飾。長期沙利度胺的治療增加了誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞激活的Kv1.3的表達(dá)，減少了CRBN對(duì)Kcna3 R4的募集，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的效應(yīng)功能。

在2018年，有研究[68]將56例肺癌腦轉(zhuǎn)移患者隨機(jī)分為兩組，每組28例。實(shí)驗(yàn)組在放療基礎(chǔ)上聯(lián)合沙利度胺，觀察兩組的有效率及疾病進(jìn)展時(shí)間。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組客觀有效率為71.4%，對(duì)照組客觀有效率為42.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者的中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別為8.2個(gè)月和5.9個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在2019年，將78例晚期NSCLC患者分為研究組（n=41）和對(duì)照組（n=37），研究組接受沙利度胺聯(lián)合GP（吉西他濱+順鉑）方案化療，對(duì)照組接受單純GP方案化療。隨訪18個(gè)月，觀察并比較兩組患者的卡氏體能狀態(tài)（Karnofsky performance status, KPS）評(píng)分。治療6個(gè)月和治療12個(gè)月后，研究組患者的KPS評(píng)分均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）[69]。兩項(xiàng)研究均表明，沙利度胺可以有效地治療肺癌。

3.2 來那度胺 免疫調(diào)節(jié)藥物來那度胺最初被批準(zhǔn)用于治療骨髓增生異常綜合征和多發(fā)性骨髓瘤[70-72]。研究[73,74]表明，來那度胺具有抗血管生成和抗腫瘤活性并表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子的生成，如抑制TNF-α的生成并上調(diào)IL-10、IL-2和IFN-γ的生成。來那度胺還可以在T細(xì)胞受體激活后誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，是T細(xì)胞活化的有效共刺激因子，導(dǎo)致T細(xì)胞的細(xì)胞因子的增加和細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化[72,73,75,76]。此外，來那度胺在沒有免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下也對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的抗增殖作用。在NSCLC中，已觀察到以來那度胺為基礎(chǔ)治療的客觀反應(yīng)，提示來那度胺是治療NSCLC的有效藥物[72]。

將人NSCLC細(xì)胞系Lu-99、H1299、A549、EBC1和H460在37oC含10%胎牛血清和抗生素的RMPI-1640培養(yǎng)液、5% CO2的加濕室中培養(yǎng)。用不同濃度的來那度胺接種于60 mm培養(yǎng)皿（2×105個(gè)細(xì)胞）中孵育不同時(shí)間。在來那度胺處理后，使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。結(jié)果顯示，來那度胺可顯著抑制NSCLC細(xì)胞（Lu-99、H1299、H460和A549）的增殖，且呈濃度依賴性[72]。

4 結(jié)語

CRBN作為E3泛素連接酶的底物，對(duì)其作用機(jī)制在多種腫瘤治療與耐藥中都進(jìn)行了研究。CRBN可調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生長、增殖和功能、調(diào)控腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移且延長無進(jìn)展生存期。CRBN作為一種免疫調(diào)節(jié)藥物分子靶點(diǎn)，具有多種潛在優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿?。關(guān)于CRBN的作用機(jī)制，CMs的調(diào)節(jié)作用和臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步研究和探討，為充分利用CRBN功能調(diào)節(jié)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來提高免疫治療藥物療效和逆轉(zhuǎn)耐藥提供更多可靠依據(jù)。