羅紅學(xué),王 悅,王建六

(北京大學(xué)人民醫(yī)院,北京 100044)

1 自取樣HPV檢測(cè)的背景和概念

高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hrHPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的必要條件。諸多研究證實(shí),HPV病毒分子的檢測(cè)技術(shù)具有比細(xì)胞學(xué)更高的高級(jí)別宮頸病變篩查敏感性,并且能提供更好的陰性預(yù)測(cè)值保護(hù),延長(zhǎng)篩查間隔時(shí)間。目前,HPV檢測(cè)已從輔助細(xì)胞學(xué)開(kāi)始逐漸替代后者成為宮頸癌初篩的主要手段[1]。HPV檢測(cè)的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是,它對(duì)樣本質(zhì)和量要求較低,故而可采用陰道自取樣。所謂自取樣是指患者自行將取樣器插入陰道采集的宮頸/陰道脫落細(xì)胞樣本,即自取樣本,可通過(guò)郵寄或集中送檢方式到達(dá)檢測(cè)機(jī)構(gòu),省時(shí)省力、簡(jiǎn)單方便,該取樣模式免除了由臨床醫(yī)生在醫(yī)院以婦科檢查方式收集患者宮頸脫落細(xì)胞樣本(醫(yī)取樣本)及其所必需的醫(yī)療成本,具有大幅度提高篩查覆蓋率的能力,尤其是在醫(yī)療資源匱乏和宗教文化抵觸的地區(qū)。已有大量證據(jù)表明,自取樣HPV檢測(cè)優(yōu)于細(xì)胞學(xué),與醫(yī)生取樣HPV檢測(cè)相比,HPV的檢出率和亞型分布具有很好的一致性,在高級(jí)別宮頸病變檢測(cè)敏感性方面也相當(dāng)[2]。近年來(lái),宮頸癌自取樣篩查的研究除了在驗(yàn)證適合的檢測(cè)技術(shù)方面有較大進(jìn)展外,自取樣的取樣方式、取樣工具、樣本的保存形式,乃至自取樣本的來(lái)源、自取樣篩查的開(kāi)展和組織形式等各個(gè)方面也有很多研究和報(bào)道,現(xiàn)就自取樣宮頸癌篩查研究進(jìn)展做綜述性介紹。

2 陰道自取樣HPV檢測(cè)技術(shù)

第二代雜交捕獲技術(shù)(Hybrid Capture 2,HC2)作為最早,也是最多被用于自取樣研究的非聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)基礎(chǔ)的HPV檢測(cè)技術(shù),其原理是利用對(duì)抗體雜交捕獲放大和收集化學(xué)發(fā)光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV相對(duì)含量的測(cè)定[3],但采用不同方式采集的陰道自取樣本進(jìn)行檢測(cè),敏感性均不如細(xì)胞學(xué)。對(duì)于自然人群CIN2+的檢測(cè),自取樣敏感性?xún)H為醫(yī)生取樣的62%～87%[4]。另一種基于雜交捕獲原理的HPV檢測(cè)方法,CareHPV檢測(cè)技術(shù),也被證實(shí)僅能達(dá)到80%敏感性[5]。Cervista作為繼HC2之后的第二個(gè)被批準(zhǔn)用于輔助細(xì)胞學(xué)篩查的HPV檢測(cè)方法,檢測(cè)原理是基于HPV-DNA酶切擴(kuò)增和信號(hào)放大技術(shù)[6],但應(yīng)用于自取樣在檢測(cè)CIN3+時(shí),僅有71%左右的敏感性[2]。Aptima是源于Hologic公司的一種新型HPV檢測(cè)技術(shù),針對(duì)的是HPV致癌基因E6和E7的mRNA,雖然不是基于PCR的檢測(cè)技術(shù),但是檢驗(yàn)過(guò)程中,在目標(biāo)捕獲完成后,mRNA將會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)核酸擴(kuò)增方法(TMA)得以擴(kuò)增。Dockter等[7]開(kāi)展的一項(xiàng)多中心對(duì)照研究結(jié)果顯示,該方法和HC2相比,敏感性相當(dāng),特異性更高。但是在兩項(xiàng)非洲研究中,Aptima方法用于檢測(cè)自取樣本,對(duì)HSIL病變的敏感性均低于醫(yī)生取樣的80%[8]。個(gè)別非PCR基礎(chǔ)上的檢測(cè)方法如DNA Chip等,檢測(cè)自取樣本獲得了較醫(yī)生取樣略高的CIN3+檢測(cè)敏感性(90.5% vs 88.1%),但研究的對(duì)象不是自然人群[9]。

2010年Wu等在一項(xiàng)橫斷面的大人群宮頸癌篩查研究SHENCCAST-II項(xiàng)目中,首次將一種基于多重PCR的基因分型加質(zhì)譜平臺(tái)檢測(cè)技術(shù)MALDI-TOF-MS應(yīng)用于自取樣的檢測(cè),獲得了與醫(yī)生取樣同樣高的CIN3+檢測(cè)敏感性(94.3% vs 94.3%),由此證實(shí)以PCR為基礎(chǔ)的HPV檢測(cè)技術(shù)是自取樣檢測(cè)成功的關(guān)鍵[2]。隨后另外幾種基于PCR的檢測(cè)方法 HR GP5+/6+、SPF10LiPA、Abbott RT HPV PCR 等被不同實(shí)驗(yàn)證實(shí)與自取樣本聯(lián)合使用也可達(dá)到與醫(yī)生取樣相當(dāng)?shù)臋z測(cè)效果,但均不是在人群篩查的研究背景下完成的。

Cobas 4800 HPV即羅氏4800,是一種集自動(dòng)樣品制備與實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)、擴(kuò)增和檢測(cè)的多重定性技術(shù),它能單獨(dú)輸出HPV16和18兩種亞型的結(jié)果和其他12種高危型別的混合結(jié)果,是目前唯一被美國(guó)FDA、歐盟CE及中國(guó)CFDA共同認(rèn)證的可用于宮頸癌初篩的HPV檢測(cè)技術(shù)。Stanczuk等[10]在2016年完成的PaVDaG研究中報(bào)道了Cobas 4800 HPV檢測(cè)陰道自取樣本與醫(yī)生取樣相比,對(duì)CIN2+/CIN3+的相對(duì)敏感性均可達(dá)97%。2014年,Yi等[11]報(bào)道了一種新型的基于新一代基因測(cè)序技術(shù)的HPV分型檢測(cè)方法(SEQ HPV),可高通量檢測(cè)14種高危型HPV并精確分型。這種HPV測(cè)序分型檢測(cè)技術(shù)與HC2檢測(cè)醫(yī)生取樣金標(biāo)準(zhǔn)的HPV檢測(cè)一致率達(dá)95%以上,CIN3+檢測(cè)敏感性約97%,與HC2檢測(cè)醫(yī)生取樣比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Du等[12]最近一項(xiàng)基于多中心萬(wàn)例自然人群的自取樣項(xiàng)目(CHIMUST)研究證實(shí),上述Cobas 4800及SEQ HPV分型技術(shù)檢測(cè)不同形式的陰道自取樣本與醫(yī)生取樣之間的HPV檢測(cè)一致性較好,CIN2+/CIN3+檢測(cè)敏感性不遜于后者。

3 陰道自取樣本采集和樣本轉(zhuǎn)運(yùn)工具

陰道自取樣本較常規(guī)醫(yī)生取樣獲取的樣本細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少,其病毒含量達(dá)不到多數(shù)基于信號(hào)放大的HPV檢測(cè)方法的最低檢測(cè)閾值。因此,采用適合的以PCR為基礎(chǔ)的HPV檢測(cè)技術(shù)是自取樣能成為有效篩查手段的第一步。此外,與之相匹配的自取樣方法和樣本保存形式也非常關(guān)鍵。同一種檢測(cè)技術(shù)針對(duì)不同工具采集的自取樣本,其HPV檢測(cè)一致性和CIN2+/CIN3+敏感性均存在不小差異。

拭子(Swab)是可選的自取樣采集工具之一,其形似小棉簽,頭部由砂紙、聚酯纖維或棉質(zhì)材料卷裹,臨床常用于外傷清創(chuàng)和皮膚上藥。干燥拭子一般保存在塑料小包中,濕拭子常配套裝在有轉(zhuǎn)換液的小管里。最新研究報(bào)道,用Cobas 4800和Abbott RT HPV兩種方檢測(cè),干濕拭子之間的HPV一致性達(dá)90%[13],取樣完畢后,將拭子放入干燥塑料管,亦可置于裝有磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌凍存管里。含自取樣本的干燥拭子可在低溫下保存3個(gè)月以上。有綜述報(bào)道,拭子自取樣本的敏感性74% ～81%,特異性88% ～90%[14]。細(xì)胞刷(Brush)是最常見(jiàn)的一種自取樣裝置之一,刷頭可有不同形狀,但一般由硬毛組成。目前市場(chǎng)上有多種產(chǎn)品,如Evalyn刷、Viba刷及錐形刷等。Evalyn刷的相關(guān)研究提示,其所取自取樣本與醫(yī)生取樣相比,HPV檢測(cè)一致性約85%[15]。自取樣刷小巧柔韌便于使用,可干燥儲(chǔ)存和運(yùn)輸,有研究報(bào)道自取樣干刷樣本保存8天左右再行檢測(cè),其結(jié)果與常規(guī)醫(yī)取樣仍具可比性。陰道塞(Tampon)由圓柱形的有吸收能力的材料構(gòu)成,在月經(jīng)期可塞進(jìn)陰道用于吸收經(jīng)血。完整陰道塞裝置還包括一個(gè)用于推送的敷料器或塑料管,常見(jiàn)的如Fournier自取樣陰道塞。陰道塞可收集大量的細(xì)胞碎片,包括宮頸和陰道壁的鱗狀上皮細(xì)胞。對(duì)于CIN患者,其吸收的細(xì)胞樣本檢測(cè)結(jié)果與其放置在陰道的時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性。有綜述報(bào)道陰道塞的診斷敏感性67% ～94%[14]。也有學(xué)者將護(hù)墊(Pad)作為自取樣工具,通過(guò)收集檢測(cè)護(hù)墊表層的經(jīng)血濾析成分來(lái)實(shí)現(xiàn)篩查宮頸病變的目的。Kim等[16]研究結(jié)果顯示,對(duì)于CIN的檢測(cè)敏感性,護(hù)墊所采集的經(jīng)血樣本為76.9%,與常規(guī)醫(yī)生取樣相比,其一致性達(dá)97.8%。

固體洗提卡(Solid elute Card)是美國(guó)GE公司生產(chǎn)的FTA卡,臨床用于新生兒出生缺陷的篩查及病毒(如HIV)和熱帶病檢測(cè)[17],其主要部件是一張具有自動(dòng)裂解細(xì)胞并吸附保存病毒DNA能力的濾紙,該濾紙片因含有變色試劑成份故可指示樣本涂抹部位。該卡片可用于儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)樣本。自取樣本可經(jīng)細(xì)胞刷或拭子獲取后涂抹在卡片上,通過(guò)打孔得到小的濾紙片,再經(jīng)簡(jiǎn)單的加熱洗滌步驟即可獲得檢測(cè)用DNA[18]。研究表明,FTA卡保存的陰道自取樣本與自取樣的液體標(biāo)本、醫(yī)生取樣之間的高危型HPV檢測(cè)一致性較好[19]。Maurer等[20]報(bào)道了一種新型的固體洗提卡“POI卡”,其構(gòu)造類(lèi)似FTA卡,但該卡對(duì)CIN2+敏感性顯著高于FTA卡(74% vs 95%),其潮濕環(huán)境下穩(wěn)定性更好。固體卡輕巧方便利于自取樣本的保存和運(yùn)輸,同時(shí)還有防止樣本污染的設(shè)計(jì),配以合適的取樣細(xì)胞刷,在自取樣研究中有巨大潛力。

4 尿液樣本的HPV檢測(cè)用于宮頸癌篩查

尿液作為一種容易獲取、非侵入性的檢測(cè)樣本近來(lái)也被用于自取樣篩查研究以及疫苗接種后的隨訪研究。據(jù)報(bào)道,尿液自取樣本與宮頸細(xì)胞樣本相比,HPV檢測(cè)敏感性能達(dá)到后者的89%[21],尿液自取樣本對(duì)陰道鏡回訪者CIN2+的檢測(cè)敏感性能達(dá)92%[22]。最近一項(xiàng)用Cobas 4800作為檢測(cè)技術(shù)的小樣本配對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示,醫(yī)生取樣和晨起初尿自取樣本之間的HPV檢測(cè)一致性為88%,以前者為金標(biāo)準(zhǔn)HPV敏感性為90.5%,以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)CIN2/3敏感性達(dá)95%[23]。HPV病毒的核酸分子到達(dá)和存在于尿液中的機(jī)制尚不明了,各項(xiàng)研究的背景也不盡相同,針對(duì)尿液的HPV檢測(cè)程序和方法目前缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。尿液檢測(cè)另一個(gè)缺點(diǎn)是其中的HPV病毒核酸分子并非明確來(lái)源于病變初發(fā)部位,其診斷提示意義尚有爭(zhēng)議。

5 自取樣HPV檢測(cè)篩查宮頸癌的模式

雖然自取樣的方式省去了陰道檢查的醫(yī)生操作步驟,患者在家中收集樣本后郵寄至檢測(cè)中心即可完成篩查,但是具體實(shí)施中還涉及婦女對(duì)篩查的認(rèn)知,個(gè)人信息的登記核實(shí),申請(qǐng)參與和獲得取樣器的流程,以及對(duì)自取樣操作步驟的了解。網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)和移動(dòng)通信設(shè)備為此提供了支持,如專(zhuān)業(yè)的門(mén)戶(hù)網(wǎng)站、社交平臺(tái),國(guó)外的FaceBook,國(guó)內(nèi)的微信朋友圈及公眾號(hào)等,均可以很方便地實(shí)現(xiàn)篩查相關(guān)知識(shí)的宣傳普及、登記申請(qǐng)、物流追蹤和檢測(cè)結(jié)果查詢(xún)。Nelson等[24]運(yùn)用互聯(lián)網(wǎng)建立招募平臺(tái)完成自取樣研究顯示,研究對(duì)象對(duì)于自取樣的接受度、舒適度的評(píng)價(jià)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未取樣者。然而此項(xiàng)研究主要針對(duì)的是21～30歲年輕女性,對(duì)于信息技術(shù)的了解和運(yùn)用熟練程度強(qiáng)于老年女性。換言之,基于互聯(lián)網(wǎng)的自取樣篩查模式能夠增加的篩查人口可能主要是來(lái)自城市年輕女性群體,這部分女性有較高的教育程度和經(jīng)濟(jì)收入,之所以未能參加篩查,除了對(duì)宮頸癌防治知識(shí)不夠了解外,主要原因可能是沒(méi)有時(shí)間、害怕麻煩或羞于婦科檢查。但自取樣篩查的模式的開(kāi)展不能局限于城市家庭式的個(gè)人取樣和郵寄,因?yàn)橛绊懻w篩查覆蓋率的還是那些經(jīng)濟(jì)狀況落后的偏遠(yuǎn)地區(qū)和不熟悉網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的未篩查婦女。Belinson研究團(tuán)隊(duì)在人口密集的發(fā)展中國(guó)家構(gòu)建和評(píng)價(jià)了一種基于社區(qū)的自取樣篩查模式,通過(guò)聯(lián)合篩查地區(qū)的權(quán)威組織機(jī)構(gòu),培訓(xùn)社區(qū)工作或村委工作的非醫(yī)務(wù)人員,并在熱衷群眾活動(dòng)的積極分子幫助下,成功實(shí)現(xiàn)了農(nóng)村地區(qū)由點(diǎn)及面的大人群自取樣篩查運(yùn)動(dòng)。集中教授自取樣方法成功完成八千余例婦女的篩查,后期陽(yáng)性回叫率達(dá)到了84.3%[25]。這種基于社區(qū)的自取樣篩查模式成功關(guān)鍵很大程度依賴(lài)社區(qū)人員的責(zé)任心、工作熱情和積極性,取樣過(guò)程存在很多變量。另一個(gè)重要問(wèn)題是可能難以獲得篩查婦女的完整身份信息和病史記錄,可能導(dǎo)致重復(fù)篩查,對(duì)于檢測(cè)中心來(lái)說(shuō)檢測(cè)信息的錄入也非常耗時(shí)。Wu等[26]在網(wǎng)絡(luò)自取樣篩查模式的基礎(chǔ)上嘗試探索了網(wǎng)絡(luò)與社區(qū)相結(jié)合的自取樣篩查模型,成功募集到預(yù)期數(shù)目的篩查人群,并實(shí)現(xiàn)了城市與農(nóng)村地區(qū)篩查婦女的線上登記。在此模型中,社區(qū)工作人員僅需要集中篩查人群,協(xié)助他們登陸篩查中心的網(wǎng)站、填寫(xiě)個(gè)人信息、獲取篩查編號(hào)、發(fā)放和郵寄自取樣器材。參與篩查的婦女可從網(wǎng)站上悉知篩查相關(guān)的所有信息,包括取樣視頻指導(dǎo),檢測(cè)報(bào)告解讀,以及進(jìn)一步就診指引,為上述問(wèn)題提供了可參考的解決方案。

6 自取樣存在的問(wèn)題

除尿液自取樣和護(hù)墊/月經(jīng)血自取樣完全無(wú)創(chuàng)外,其他的陰道自取樣方式因?yàn)槎夹枰獙⑷庸ぞ卟迦腙幍?所以都具有一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)和危害。陰道自取樣工具使用者必須要具備基本的文化水平,能夠閱讀理解取樣指示圖譜或步驟。不按照取樣流程隨意操作或錯(cuò)誤操作不僅無(wú)法取得滿意樣本,還會(huì)帶來(lái)一些醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn),輕者或可能穿破陰道黏膜導(dǎo)致出血引起心理壓力,重者可能感染(中毒)性休克。來(lái)自國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究顯示,教育程度可能是影響婦女接受自取樣的主要原因[27]。避免生硬晦澀醫(yī)療術(shù)語(yǔ),使用簡(jiǎn)單易懂的溫馨的圖文宣傳冊(cè)、視頻指導(dǎo)都可實(shí)現(xiàn)這一目的。此外,還需考慮到一些肥胖的婦女、解剖學(xué)異常的婦女和陰道萎縮的老年婦女,并不能適用任意自取樣工具,需根據(jù)情況個(gè)體化選擇和研發(fā)新的采集工具。

需要指出的是,由于自取樣的“自取”性質(zhì),無(wú)論采取哪種取樣工具或樣本保存介質(zhì),自取樣標(biāo)本都不可能是單一來(lái)源的陰道壁細(xì)胞或?qū)m頸脫落細(xì)胞。雖然有研究結(jié)果顯示,宮頸細(xì)胞以及陰道壁細(xì)胞的HPV檢測(cè)結(jié)果有良好的一致性,但未來(lái)當(dāng)特異性分子標(biāo)記物成為疾病預(yù)測(cè)一個(gè)重要指標(biāo)和方向時(shí),自取樣的標(biāo)本不一定依然適用。

7 自取樣HPV檢測(cè)展望

自取樣HPV檢測(cè)雖然在檢測(cè)高級(jí)別宮頸病變的敏感性方面優(yōu)于細(xì)胞學(xué),甚至接近醫(yī)生取樣HPV檢測(cè)的結(jié)果,但是同樣存在所有HPV檢測(cè)共同的特異性較差的問(wèn)題[28]。醫(yī)生取樣在HPV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性時(shí),可以用同一樣本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測(cè)以實(shí)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)分層和二次篩查,但自取樣本已被證實(shí)無(wú)法獲得滿意細(xì)胞制片,細(xì)胞學(xué)檢測(cè)效果差[29]。所以患者仍需再次前往醫(yī)院采集滿意細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(ACS)2015年發(fā)布的宮頸癌篩查臨時(shí)指南開(kāi)始推薦使用HPV16/18作為HPV陽(yáng)性的分流指標(biāo)[30]。目前多數(shù)自取樣篩查研究中涉及的基于PCR的HPV檢測(cè)技術(shù),如Abbott RT HPV、MALDI-TOF-MS、Cobas 4800 HPV、HPV基因測(cè)序分型檢測(cè)技術(shù)(SEQ HPV)等均可報(bào)告HPV16/18的分型或其他單獨(dú)的高危亞型結(jié)果,因此結(jié)合不同地區(qū)HPV亞型與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)程度,對(duì)這部分自取樣HPV16/18或其他高危亞型陽(yáng)性進(jìn)行分流和平衡篩查敏感性和特異性,提高篩查效率[31]。最近有研究報(bào)道,人類(lèi)某些基因的超甲基化與宮頸癌的發(fā)病有強(qiáng)相關(guān)性,或可應(yīng)用于自取樣本的 HPV陽(yáng)性分流[32]。p16/ki67也是最近研究較熱的一組分子標(biāo)記物,細(xì)胞免疫雙染對(duì)HPV感染者CIN2+/CIN3+的檢測(cè)有較高的敏感性和特異性。由于該分子染色不依賴(lài)細(xì)胞形態(tài)學(xué),所以可適用于數(shù)目和質(zhì)量均要求不高的陰道自取樣本的檢測(cè),未來(lái)有很大潛力成為自取樣HPV檢測(cè)陽(yáng)性者的分流參考指標(biāo)之一[33-34]。HC2雖被證實(shí)并不適用于自取樣本的檢測(cè),但其檢測(cè)結(jié)果可反映出HPV感染的相對(duì)病毒載量,鑒于病毒載量與宮頸病變級(jí)別的高相關(guān)性[35],最近也有學(xué)者認(rèn)為病毒載量檢測(cè)可用作HPV分型檢測(cè)后的二次篩查補(bǔ)充,這樣既可回避HC2檢測(cè)自取樣本的不敏感性,又可利用高病毒載量的對(duì)高級(jí)別宮頸病變的特異性,從而優(yōu)化各項(xiàng)篩查效果評(píng)定指標(biāo)[36]。在此基礎(chǔ)上,Wu的研究團(tuán)隊(duì)最近報(bào)道,可將Cobas 4800檢測(cè)中反映病毒拷貝數(shù)的循環(huán)閾值(Ct值)作為反映HPV病毒載量的指標(biāo),設(shè)定特定閾值進(jìn)行對(duì)HPV陽(yáng)性者的分流,并獲得了理想篩查效率[37]。上述研究為實(shí)現(xiàn)零細(xì)胞學(xué)的自取樣HPV檢測(cè)宮頸篩查模式提供了方向。

綜上所述,自取樣HPV檢測(cè)因其經(jīng)濟(jì)、方便、安全、保護(hù)隱私以及檢測(cè)準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn),在提高宮頸癌篩查覆蓋率、HPV疫苗接種或?qū)m頸病變患者干預(yù)后的隨訪等方面具有巨大潛力和應(yīng)用價(jià)值。然而,自取樣HPV檢測(cè)作為初篩手段的宮頸癌篩查模式的建立,首先需要優(yōu)化組合自取樣本的采集、保存、檢測(cè)等各個(gè)環(huán)節(jié)。同時(shí),在推廣實(shí)施前,還需要有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的、合理有效的陽(yáng)性者的分流方案來(lái)平衡篩查和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)效益。