劉瑩 孫燕

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率在2018年全球新增癌癥病例中居第4 位，死亡率居第2位[1]。CRC 在中國女性和男性腫瘤患者中的發(fā)病率分別居第4 位和第5 位，死亡率均居第5 位[2]。目前，CRC 的治療手段仍以手術(shù)和放化療為主，近年來靶向治療和免疫治療也在CRC 中不斷開展。研究報道錯配修復(fù)缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）/微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型（microsatellite instability-high，MSI-H）的CRC 患者常伴有大量的免疫細胞浸潤，更可能受益于免疫治療[3]。一些學(xué)者積極探索腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中發(fā)生的免疫反應(yīng)對CRC 發(fā)生發(fā)展的影響以及如何通過免疫治療改善CRC 患者的預(yù)后，其中就包括調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）的作用和/或治療價值[4]。Treg 在宮頸癌、乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤中與不良預(yù)后有關(guān)[4]，但在CRC 中的作用和對預(yù)后的影響尚存在爭議。本文就Treg 在CRC 發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為潛在治療靶點時可能采取的治療策略進行綜述。

1 Treg 的來源及功能

Treg 是一類對控制自身耐受和炎癥反應(yīng)至關(guān)重要的T 細胞亞群，分為CD4+Treg 和CD8+Treg 兩種類型[5]。CD4+Treg 已被廣泛研究，但CD8+Treg 因缺乏特異性標記而導(dǎo)致相關(guān)研究較為局限。兩者在功能上存在部分差異，一個非常明顯的區(qū)別是CD8+和CD4+Treg 分別識別主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ或MHC-Ⅱ呈遞的同源抗原，由于MHC-Ⅰ幾乎存在于所有的有核細胞，CD8+Treg 可以被幾乎所有細胞激活抑制活性，CD4+Treg 僅激活于表達MHC-Ⅱ的細胞[5]。本文主要對CD4+Treg 的來源、相關(guān)功能和治療進行闡述。

最初，Treg 被定義為表達CD4 和CD25 的抑制性細胞，隨后研究發(fā)現(xiàn)叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)oxP3）是Treg 發(fā)揮抑制作用的主要調(diào)節(jié)因子[6]。而FoxP3 在CD4+Treg 中表達水平是不同的，低表達FoxP3 的CD45RA+CD25lowTreg 被認為處于靜息狀態(tài)，免疫抑制能力較弱，在TCR 的刺激下可以分化為高表達FoxP3 的活化型Treg[6]。Treg 存在兩條發(fā)育途徑[7]，胸腺來源的Treg（thymic Treg，tTreg）依賴于與自身肽或MHC-Ⅱ的高親和力相互作用，外周來源的Treg（peripheral Treg，pTreg）則需要依靠轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）激活幼稚T 細胞，白介素（interleukin，IL）-4 和IL-6 缺乏也可以導(dǎo)致pTreg 的發(fā)育。

Treg 表面表達多種黏附因子和趨化因子受體，因此Treg 并不具備一致的表型，這些受體可以針對次級淋巴組織、非淋巴組織及炎癥部位[7]。在次級淋巴組織中，Treg（主要是靜息狀態(tài)的Treg）可以通過抑制抗原提呈細胞的功能抑制T 細胞的活化。非淋巴組織中廣泛存在被活化的Treg，通過表達不同的黏附因子和趨化因子受體，調(diào)節(jié)多種效應(yīng)細胞靶點的活性，抑制炎癥反應(yīng)，防止組織損傷和自身免疫，維持非淋巴組織的耐受性[6-7]。

2 結(jié)直腸癌中Treg 的產(chǎn)生途徑及作用

2.1 腫瘤局部浸潤的Treg 的產(chǎn)生途徑

與正常Treg 產(chǎn)生過程不同，TME 中多重因素可共同影響Treg 生成。其中趨化因子可以從胸腺、骨髓、淋巴結(jié)和外周血招募Treg 到腫瘤局部并刺激Treg 增殖，功能失調(diào)的抗原提呈細胞也可以誘導(dǎo)Treg 分化和增殖；此外，TME 中的抑制性分子能直接將CD4+CD25+T 細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+FoxP3+的Treg[6]。與健康人相比，CRC 患者外周血中Treg 百分比增加，并且Treg 的浸潤水平在CRC 組織中高于正常組織和周圍組織，離腫瘤最近的區(qū)域淋巴結(jié)高于遠處淋巴結(jié)和非區(qū)域淋巴結(jié)[8-9]。

2.2 Treg 在CRC 中的作用

Treg 不僅通過表達CD39、上調(diào)細胞毒性T 淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）和程序性死亡受體-1（programmed death -1，PD-1）等的表達獲得更強的免疫抑制功能[10-11]，還可以通過分泌IL-10 和IL-35 協(xié)同調(diào)節(jié)CD4+和CD8+TIL 中的BLIMP1 抑制性受體軸，阻礙有效的抗腫瘤免疫[12]，并且以減少內(nèi)皮細胞CXC 趨化因子配體10 產(chǎn)生[13]的方式抑制T 細胞遷移到腸道腫瘤。除此之外，Treg 不僅對腫瘤特異性抗原具有特異性反應(yīng)[14]，還可以通過調(diào)節(jié)IL-6 表達調(diào)控CRC 細胞生長[15]，并通過抑制Th1 的生物學(xué)活性進而抑制Th1 分泌血管生成抑制因子（TGF-β 等），以及產(chǎn)生血管生成因子神經(jīng)菌毛素-1（neuropilin-1，NRP-1）等間接或直接促進CRC 血管生成[16-17]。

盡管Treg 的免疫抑制作用有利于腫瘤細胞逃避抗腫瘤免疫，有研究認為至少在炎癥相關(guān)性腫瘤發(fā)生的早期，Treg 可能通過抑制炎癥反應(yīng)阻礙腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。并且Treg 對CRC 預(yù)后的影響也存在爭議，部分研究認為Treg 與預(yù)后良好有關(guān)[19]，另一些認為Treg 與不良預(yù)后有關(guān)[20-21]，Saito 等[20]報道這種差異可能是因為FoxP3+T 細胞存在不同亞群，即eTreg 和non-Treg，兩者難以通過免疫組織化學(xué)標記區(qū)分。與以non-Treg 浸潤為主的CRC 相比，具有大量eTreg浸潤的CRC 患者預(yù)后更差。

2.3 腫瘤微環(huán)境對Treg 的影響

腫瘤細胞及其所處的TME 對Treg 同樣具有調(diào)控作用。除分泌趨化因子招募Treg 到腫瘤部位外[22]，CRC 細胞中的局灶性黏附激酶也可以通過調(diào)節(jié)趨化因子和細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達，驅(qū)動并調(diào)控Treg 的募集和浸潤水平[23]。另外，腸道微生物也可能通過促進Treg 的積累參與免疫抑制[24]。

3 Treg 作為治療結(jié)直腸癌的潛在靶點

Treg 介導(dǎo)的外周免疫耐受是免疫治療過程中要克服的難題，因此在治療時為了消除Treg 的免疫抑制活性，往往考慮剔除或抑制Treg，增加效應(yīng)T 細胞的活性和積累，從而達到免疫治療的目的。有研究報道，自20 世紀開始就有學(xué)者試圖通過耗竭Treg 進行治療，如使用低劑量的環(huán)磷酰胺、靶向特定表面標記（CD25）等[6]。免疫檢查點作為近年來免疫治療的熱門領(lǐng)域被廣泛研究，在包括轉(zhuǎn)移性MSI-H/dMMR 型CRC 在內(nèi)的多種癌癥中顯示出良好的效果[3]，并且已經(jīng)證實Treg 可以表達包括CTLA-4、PD-1 及其配體（programmed death-ligand 1，PD-L1）等在內(nèi)的多種表面標記[25]，進一步提示靶向Treg 在免疫治療中的重要性。此外，聯(lián)合治療、針對Treg 表面受體（如糖蛋白A 重復(fù)序列等）等的治療策略也已展開研究[26-27]。

3.1 免疫檢查點抑制劑

目前臨床常用的免疫檢查點是CTLA-4 和PD-1/PD-L1，而MSI-H/dMMR 已被確定為對免疫檢查點抑制劑反應(yīng)的標志物。

3.1.1 CTLA-4 抑制劑 如前所述，CTLA-4 在活化的T 細胞表面表達，表達上調(diào)后可以通過與CD28 競爭CD80/CD86 從而中斷TCR 信號傳遞，抑制T 細胞活化進而維持腫瘤細胞的存活[11]?？笴TLA-4 的主要機制是通過抗體依賴的細胞毒性作用介導(dǎo)Treg 耗竭，阻斷CTLA-4 與CD80/CD86 的相互作用，促進T 細胞增殖而激活抗腫瘤免疫[11]。CTLA-4 抑制劑包括ipilimumab（已上市）和temelimumab，主要用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌和膀胱癌[25]，在CRC 中主要集中于與PD-1/PD-L1 抑制劑聯(lián)合使用。

3.1.2 阻斷PD-1/PD-L1 PD-1 也稱CD279，是免疫球蛋白超家族，有兩個主要的配體PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-1 與PD-L1 結(jié)合可以使T 細胞增殖受抑制，最終導(dǎo)致T 細胞耗竭[6]。PD-1/PD-L1 抑制劑主要包括pembrolizumab（已上市）、nivolumab（已上市）和durvalumab、atezolizumab（已上市）、avelumab，可以恢復(fù)效應(yīng)T 細胞的功能，增加CD8+T/Treg 比率來負調(diào)節(jié)Treg 的數(shù)量[25]。近年的臨床研究表明，MSI-H/dMMR 的轉(zhuǎn)移性CRC 更容易從PD-1抑制劑中獲益，在微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）/錯配修復(fù)完整（mismatch repair proficiency，pMMR）的CRC 幾乎無應(yīng)答[3]。Andre 等[28]評價了pembrolizumab 作為一線治療方法與標準化療在dMMR 的轉(zhuǎn)移性CRC 中的療效與安全性，結(jié)果顯示pembrolizumab 作為一線治療方法后中位無進展生存（progression-free survival，PFS）有所改善（16.5 個月vs.8.2 個月，HR=0.6，P=0.000 2），且出現(xiàn)3～5 級藥物相關(guān)不良事件低于標準化療（22%vs.66%）。

3.2 聯(lián)合治療策略的臨床前或臨床研究

3.2.1 CTLA-4 抑制劑聯(lián)合PD-1/PD-L1 抑制劑治療 目前，已在MSI-H/dMMR 的轉(zhuǎn)移性CRC 中進行多項小劑量ipilimumab 聯(lián)合nivolumab 使用的臨床研究，客觀反應(yīng)率可達55%～69%，PFS 和總生存（overall suvival，OS）較單一PD-1 抑制有所提高（1年P(guān)FS 及OS 分別為71%vs.41%，85%vs.76%）[26,29]。小劑量ipilimumab 聯(lián)合nivolumab 的治療策略展示了強大而持久的臨床效益，或許為MSI-H/dMMR 的轉(zhuǎn)移性CRC 患者提供了新的一線治療方案。

3.2.2 PD-1 抑制劑聯(lián)合血管內(nèi)皮細胞生長因子受體抑制劑治療血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體VEGFR 的激活與免疫抑制微環(huán)境有關(guān)，通過增加抑制性免疫檢查點表達和募集免疫抑制細胞（包括Treg 和髓源性抑制細胞），在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮作用[30]。最近一項VEGFR 抑制劑regorafenib 聯(lián)合PD-1 抑制劑使用的回顧性研究納入了23 例MSS/pMMR 型CRC 病例，結(jié)果顯示治療后無患者達到客觀反應(yīng)率，但疾病控制率為78.3%[31]。另一項納入25 例CRC 和25 例胃癌的Ⅰ期臨床試驗顯示nivolumab 聯(lián)合regorafenib 使用后客觀反應(yīng)率為36%（包括7 例MSS CRC，1 例MSI-H CRC），中位PFS為6.3個月，1年P(guān)FS和1年OS為分別為41.8%和68%，治療前后Treg 數(shù)量顯著減少（NCT 04030260）。為了更好地評估該策略對MSS CRC 的療效，有必要納入更多病例進行進一步研究。

3.2.3 納米載體聯(lián)合吲哚胺2,3-雙加氧酶1 抑制劑 為了實現(xiàn)高效的免疫治療，Hu 等[32]設(shè)計了用于多種免疫調(diào)節(jié)劑的超分子前藥物納米載體。將光敏劑透明質(zhì)酸、焦脫鎂葉綠酸A 和吲哚胺2,3-雙加氧酶1（indoleamine2,3-dioxygenase 1，IDO1）抑制劑NLG 919 整合到超分子納米載體中，即光動力免疫治療聯(lián)合IDO1 阻斷，可以導(dǎo)致Treg 數(shù)量減少并抑制CRC小鼠模型（CT26）腫瘤生長，延長其存活率（P＜0.001）。這種納米平臺能否應(yīng)用并改善其他免疫調(diào)節(jié)因子的療效仍需進一步研究。

3.3 靶向Treg 表面受體及標記物的治療策略

3.3.1 靶向Treg 表面糖蛋白A 重復(fù)序列 糖蛋白A重復(fù)序列（glycoprotein A repetitions predominant，GARP）在活化的Treg 表面表達，可以結(jié)合并激活TGF-β，與疾病進展和免疫逃逸有關(guān)。Salem 等[27]在結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌模型中觀察到缺乏GARP 的Treg 抑制炎癥反應(yīng)的能力降低，抗腫瘤免疫得到改善，腫瘤進展減緩。但Vermeersch 等[33]在小鼠結(jié)腸癌模型中的研究顯示，敲除GARP 并未延遲腫瘤生長，GARP 的缺失不足以影響Treg 的免疫抑制活性。GARP 抑制劑在CRC 領(lǐng)域是否能成為靶點仍需進一步驗證。

3.3.2 靶向Treg 表面內(nèi)皮糖蛋白 內(nèi)皮糖蛋白（endoglin）是TGF-β 的輔助受體，在內(nèi)皮細胞、癌癥相關(guān)成纖維細胞等上高表達，Schoonderwoerd 等[34]報道內(nèi)皮糖蛋白可以在小鼠和人CRC 組織中的Treg 上高表達，而不存在于常規(guī)CD4+T 細胞上。抗內(nèi)皮糖蛋白抗體（TRC105）在乳腺癌等動物模型中顯示了抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[35]。在CRC 動物模型中使用TRC105 治療可以減少腫瘤中Treg 的數(shù)量，TRC105 聯(lián)合PD-1 抑制劑使用顯著增強了PD-1 抑制劑在CRC 動物模型（皮下、原位和化學(xué)誘導(dǎo)）中的療效[34]。這種策略已在轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌中進行Ⅰ期研究（NCT 03181308），在CRC 中能否成為靶點需進一步研究。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，Treg 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用涉及到調(diào)控腫瘤免疫、血管生成和腫瘤細胞增殖等多個方面，并與腫瘤微環(huán)境中的各種成分存在相互作用，是一個十分有研究意義的靶點。Treg 在CRC 中的作用存在爭議可能與研究中涉及的細胞亞群不同和所選研究群體的腫瘤分期不同有關(guān)。目前，免疫治療多以耗竭或抑制Treg 為目標，對Treg 各亞群進行準確的評估，對于預(yù)測CRC 患者預(yù)后和選擇合適的治療策略具有重要意義。應(yīng)繼續(xù)研究靶向Treg 或進行聯(lián)合治療的治療策略，在維持免疫平衡的前提下選擇性地抑制Treg，發(fā)揮效應(yīng)T 細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的優(yōu)勢，進而達到有效治療的目的。