薛海燕，吳劍，張穎，宋宏新，賀寶元

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）

（2.陜西科技大學輕工科學與工程學院，陜西西安 710021）

β-乳球蛋白是牛乳中的主要蛋白質，分子量18.2 ku，等電點5.3[1]。β-乳球蛋白是反芻動物如牛、羊和單胃動物乳中的主要成分，容易引發(fā)免疫反應出現(xiàn)過敏現(xiàn)象，是牛乳中最主要的過敏原之一[2]。羊乳β-lg與牛乳β-lg 的天然構象不同，而且羊乳中的β-lg 含量低于牛乳，羊乳的過敏發(fā)生率較低[3]。羊乳的營養(yǎng)成分和牛乳接近，但是羊乳的營養(yǎng)比例比牛乳更加合理，更容易消化吸收[4]。Native-PAGE 電泳圖譜顯示，牛羊乳蛋白差異主要體現(xiàn)在清蛋白上，牛乳β-lg 位于凝膠底部，且是兩條變異條帶，而羊乳β-lg 僅有一條條帶，位于電泳圖的中間[5]。我國山羊養(yǎng)殖規(guī)模不大，山羊的生長周期長，泌乳期短，羊乳產(chǎn)量少，且極易受季節(jié)的影響[6,7]，因此羊乳資源相對匱乏，市場價格較高。牛乳與羊乳在外觀、營養(yǎng)成分上極為相似，一些不法商家借在羊乳中摻入牛乳來降低生產(chǎn)成本，達到盈利的目的。這種行為不僅損害了消費者的權益，還會對牛乳過敏的消費群者造成極大的傷害。因此，迫切需要建立一種快速檢測羊乳中摻入牛乳的方法。

最常用的檢測牛羊乳摻假的方法有電泳檢測技術，色譜技術，PCR 技術，ELISA 技術等。傳統(tǒng)的SDS-PAGE 方法很復雜，難以量化，而且牛羊乳的成分和性質也比較相似，用該技術檢測更加困難。如果電泳和色譜技術聯(lián)用，測定結果更加準確，并且不僅可以實現(xiàn)定性檢測，還可以用于定量。但其實驗設備繁重，時間長；氣相和液相色譜法準確且可重復[8,9]，但制備樣品過程繁瑣，時間長且需要大量標品；PCR檢測技術特異性強，速度快，但此法需要較高的專業(yè)技能，所需試劑成本也高，不適用于快速的現(xiàn)場檢測[10,11]；ELISA 技術靈敏度高，特異性好，操作也相對簡單[12]。但該法不僅需要特定的儀器，實驗時間也長，現(xiàn)場大規(guī)模乳制品的檢測不適合采用此法。與其他技術相比，膠體金免疫層析技術是一種簡單而快速的檢測技術[13,14]。它是目前快速準確適用于現(xiàn)場的檢測技術手段。該技術操作簡單，時間短，易攜帶，結果直觀，適合于現(xiàn)場大規(guī)模的檢測。

本文選擇牛乳β-乳球蛋白作為抗原，免疫小鼠，經(jīng)過細胞融合，篩選了6 株雜交瘤細胞，并對細胞株進行培養(yǎng)，根據(jù)小鼠體內誘生腹水法制備特異性高的單克隆抗體。利用該抗體研制可快速檢測羊乳中牛β-乳球蛋白膠體金免疫層析試紙條。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠體金、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC 底板，上海杰一生物技術有限公司；牛β-乳球蛋白、牛α-乳白蛋白、BSA、牛α-酪蛋白、牛β-酪蛋白、牛κ-酪蛋白，西安優(yōu)博生物科技有限公司；單克隆抗體，上海友科生物科技有限公司；羊抗鼠IgG，北京博奧森生物技術有限公司；全脂羊奶粉、脫脂羊奶粉，實驗室自制；液態(tài)羊乳，本地牧場；配方羊奶粉，本地超市購買。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司（芬蘭）；移液槍，德國Brand 公司；酶標板（聚苯乙烯板）96 孔，北京鼎國生物技術有限公司；Smart系列超純水儀，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；101-2A 型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀MK3，熱電（上海）儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州科豐儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗體制備

以牛β-乳球蛋白為免疫原，采用腹腔注射法免疫BALB/c 小鼠，經(jīng)細胞融合，篩選能穩(wěn)定分泌β-lg 單克隆抗體的細胞株，通過小鼠體內誘生腹水法可以大量制備單克隆抗體，并對抗體的純度進行鑒定。

1.3.2 抗體效價及親和力的測定

用碳酸鹽包被緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）包被抗原（200 μL/孔），4 ℃放一夜，第二天，先倒出板內前一天包被的液體，然后用300 μL PBST 溶液進行洗滌，洗滌三次，每次3 min；每孔加100 μL 明膠進行封閉，在37 ℃烘箱內放置50 min，同上述洗滌一樣，加入抗體，100 μL/孔，37 ℃恒溫于濕盒內孵育1.5 h，洗滌同上，加羊抗鼠酶標二抗，100 μL/孔，再次于恒溫箱中孵育1.5 h，洗滌后加入顯色液和終止液，用酶標儀在450 nm 的波長下，測定其吸光值。

利用間接ELISA 測單抗親合力。牛β-lg 按5、2.5、1.25、0.625 μg/mL 包被酶標板。單克隆抗體從10 倍開始倍比稀釋。以單克隆抗體（mol/L）的對數(shù)為橫坐標、OD450nm為縱坐標，繪制4 條S 形曲線。以S 形曲線的頂部為最大光密度ODmax，求出各曲線50%ODmax 對應的單克隆抗體濃度（IC50，mol/L）。將4個濃度兩兩分組，根據(jù)公式計算親合力常數(shù)。

式中：Ka 為親合力常數(shù)；n 為每組中兩個包被抗原濃度的倍數(shù)；[Ab’]t 和[Ab]t 分別為每組中兩條曲線IC50 對應的抗體濃度（mol/L）。

1.3.3 單抗特異性分析

以牛α-CN、羊α-CN、牛α-LA（α-Lactalbumin，α-LA）和牛血清白蛋白（BSA）為抗原，一抗為牛β-lg 單抗，二抗為酶標羊抗鼠，以陰性血清作為對照，采用間接ELISA 法進行測定，步驟參照小鼠血清效價的方法。

1.3.4 膠體金的制備和表征

用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。100 mL 去離子水放在磁力攪拌器上加熱攪拌，沸騰后加入2 mL 1%氯金酸，煮沸后再迅速加入1 mL 1%檸檬酸三鈉溶液顏色變?yōu)榉€(wěn)定的酒紅色，冷卻后定容至100 mL，置于4 ℃避光保存。

1.3.4.1 最適標記膠體金PH 值確定

取5 個1.5 mL 的EP 管，加入1 mL 膠體金，分別加入5、10、15、20、25 μL 0.02 M 的K2CO3溶液調節(jié)pH，再分別加入4 μL 單抗，混勻放在4 ℃靜置20 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻靜置10 min，觀察EP 管顏色變化，使溶液保持紅色的最低pH 值確定為最適pH 值。

1.3.4.2 最適標記抗體濃度

取6 個1.5 mL 的EP 管，各加入1 mL 膠體金溶液，分別加入0.02 M K2CO3溶液10 μL，分別加入濃度50、25、12.5、6.25、3.1、1.5 μg/mL 的單抗5 μL?；靹蜢o置20 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻靜置10 min，觀察EP 管顏色變化，使溶液保持紅色的最低pH 值確定為最適抗體濃度。

1.3.4.3 最適標記抗體量

取6 個1.5 mL 的EP 管，各加入1 mL 膠體金溶液，分別加入0.02 M K2CO3溶液10 μL，分別加入濃度25 μg/mL 的單抗2、3、4、5、6、7 μL?；靹蜢o置20 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻靜置10 min，觀察EP 管顏色變化，使溶液保持紅色的最低pH 值確定為最適抗體量。

1.3.5 膠體金試紙條的方法的建立

1.3.5.1 金標墊和金標溶液的制備

向10 mL 離心管中加入1 mL 膠體金溶液，加入最適K2CO3溶液，再加入最適濃度的單抗，混勻靜置20 min，加入20.0 μL 20%的BSA，混勻靜置20 min。4 ℃，10000 r/min 離心10 min，棄上清，使用金標抗體復溶液200 μL 進行復溶。

將玻璃纖維素膜裁剪成2 cm×1.4 cm大小的條帶，把制備的膠體金標溶液均勻的覆蓋在玻璃纖維素膜條帶上，置于37 ℃烘箱烘干，4 ℃保存。

1.3.5.2 NC 膜的處理

將硝酸纖維素膜裁剪成2 cm×2 cm 大小的條帶，離膜上端0.75 cm 處用劃膜機包被1 mg/mL 的單克隆抗體作為檢測線，離膜下端0.5 cm 處包被l mg/mL 的羊抗鼠IgG二抗作為質控線。置于37 ℃烘箱烘干，4 ℃保存。

1.3.5.3 膠體金試紙條的組裝

在PVC 板上依次粘貼NC 膜、金標墊、樣品墊、吸水墊，各部分重疊約2 mm，用切條機切成0.5 cm寬的試紙條，裝入塑料外殼中。

1.3.6 試紙條靈敏度測試

用PBS 將牛β-lg 標準品稀釋至100、50、25、12.5、6.75、3.37、1.6 μg/mL。各加100 μL 于加樣處，反應15 min，觀察NC 膜的顯色情況，以T 線顯色最淺時的稀釋度作為試紙條最低檢測濃度。

1.3.7 試紙條特異性測試

用PBS 緩沖液配制12 μg/mL 牛α-CN，β-CN，k-CN，BSA，α-LA，β-lg 標品溶液。用試紙條檢測不同蛋白溶液，觀察NC 膜的顯色情況。

1.3.8 脫脂羊乳摻假的間接ELISA 法

向脫脂羊乳中加入脫脂牛乳，加入的體積分數(shù)分別為0%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%，以摻入后的樣本為檢測目標，采用間接ELISA 法進行檢測，觀察牛乳摻入量與吸光值的關系，操作如1.3.2.

1.3.9 牛羊乳混合樣品及市售羊乳的檢測

向羊乳中分別加入1%、2%、5%、10%、30%、40%、60%、80%、100%的牛乳形成牛羊乳混合樣品。收集市售全脂羊乳粉及嬰幼兒配方羊乳粉樣本7 個（全脂羊奶粉，液態(tài)羊奶，配方羊奶粉），用所制備的試紙條檢測，并和ELISA 檢測方法做對照。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

單克隆抗體效價、特異性、親和力的測定均做3次平行試驗，結果以平均值表示，文中圖表采用Excel 2010 和Origin 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 β-lg 單克隆抗體純度的鑒定結果

篩選6 株細胞株用做亞克隆并制備單克隆抗體，編號為1-6，用SDS-PAGE 的方法檢測純化后的單克隆抗體純度。由圖1 可知，2-7 號泳道單抗的電泳圖譜只有2 個條帶，分子量分別為26 ku 和50 ku，和標準IgG 一致，表明純化后的抗體純度較高。Quantity One 軟件對泳道的條帶進行分析，得出抗體純度都在90%以上，可用于進行下一步的實驗。

圖1 單抗純度鑒定結果Fig.1 Etermination of mouse antiserum titer

2.1.1 抗體效價和親和力的測定

圖2 單抗效價的檢測Fig.2 Monoclonal antibody titer assay

圖3 親和力測定結果Fig.3 Affinity measurement result

單抗效價檢測采用間接ELISA 法。由圖2 可知，這6 株單抗的效價均達到10000 以上，其中單抗4 的效價最高為 1:1.28×106，單抗 6 的效價最低為1:2.0×104。單抗4 的效價遠遠高于其他5 種單抗，如圖3 所示，經(jīng)計算，單抗4 的親和力常數(shù)為2.6×107，是高親和力抗體。因此本試驗選擇效價高親和力高的抗體4 作為后續(xù)的實驗研究。

2.1.2 單抗特異性鑒定結果

由表1 可知，牛β-lg 單克隆抗體與牛α-CN、羊α-CN、牛α-LA、牛β-lg 和BSA 發(fā)生反應，算得P/N值都小于2.1，說明該試驗制得的單抗特異性高。

表1 單克隆抗體特異性Table 1 The immune scheme for mouse

2.2 膠體金的制備和表征

2.2.1 膠體金的鑒定

圖4 膠體金顆粒性質Fig.4 Properties of colloidal gold nanoparticles

圖4a 為膠體金和免疫金的紫外-可見全波長掃描，體系的最大吸收波長和半峰寬并無明顯變化，說明標記結果穩(wěn)定。金納米粒徑為30～40 nm 之間最適合應用于膠體金免疫層析檢測[15]。通過透射電鏡掃描，本實驗所獲得的膠體金顆粒直徑為30 nm，適合用于抗體標記。

2.2.2 最適標記膠體金pH 值

圖5 膠體金標記β-lgmAb 的最適pH 值的確定Fig.5 Determination of the optimal pH value of colloidal gold labeled β-lgmAb

抗體加進膠體金后，其活性和結合效率受pH 值的影響[16]。但是金納米粒會對pH 計的電極有影響[17]，故本實驗采用不同體積的0.1 mol/L K2CO3調節(jié)膠體金溶液的pH 值。如圖5a 所示，隨著K2CO3加入量的增加，免疫金的顏色也從藍紫色變?yōu)榫萍t色，通過同樣條件檢測（T 線1 mg/mL，C 線0.5 mg/mL，陰性為0.01 mol/L PBS 緩沖液，陽性為50 μg/mL 牛β-lg 溶液），選擇陰性T 線顯色明顯，陽性T 線褪色明顯的條件。如圖5b，選擇1.0 mL 膠體金溶液中加入0.2 mol/L 的K2CO3溶液10.0 μL。

2.2.3 最適標記抗體濃度

圖6 膠體金標記β-lgmAb 的最適抗體濃度的確定Fig.6 Determination of optimal antibody concentration of colloidal gold labeled β-lgmAb

在1.0 mL 膠體金中加入不同濃度β-lg 抗體，通過同樣條件檢測（同上），由圖6b 可知，抗體加入濃度小于3.13 μg/mL 時，T 線顏色不明顯，當抗體濃度為12.5 μg/mL 時，T 線顏色明顯。當T 線和C 線顯色明顯時，抗體用量越少，T 線上包被的抗原與待測物質的競爭越激烈，試紙條的反應性越高[18]。當標記抗體濃度為12.5 μg/mL 時，符合檢測要求，而且在后期實驗中有很好的穩(wěn)定性。

2.2.4 最適標記抗體量

在1.0 mL 膠體金中加入不同體積的β-lg 抗體，通過同樣條件檢測（同上），由圖7a 可知，膠體金顏色為酒紅色，顏色穩(wěn)定不再變化，如圖7b 所示，標記的抗體加入體積小于5.0 μL 時陰性T 線顏色不明顯，當抗體加入量為6.0 μL 時陰性T 線顯色明顯。當標記抗體量6.0 μL 時，能滿足檢測要求。因此選擇1.0 mL膠體金溶液中加入6 μL 抗體進行標記。

圖7 膠體金標記β-lgmAb 的最適抗體量的確定Fig.7 Determination of the optimal amount of antibody to colloidal gold labeled β-lgmAb

2.3 試紙條靈敏度試驗

從圖8 和表2 可知，β-lg 濃度增加，NC 膜上T線顏色逐漸變淺。當樣本中β-lg 濃度為0.78 μg/mL 和1.56 μg/mL 時，NC 膜的顏色清晰；當β-lg 濃度大于3.13 μg/mL 時，NC 膜上T 線上沒有顏色，是因為檢測溶液中的β-lg 與金標抗體反應，形成金標抗體復合物，該復合物經(jīng)過NC 膜時，與T 線上的抗原結合較少，顏色會越來越淺。因此本試驗牛β-lg 濃度為3.13 μg/mL 作為最低檢測限。

He[19]以β-LG 為抗原制備單克隆抗體，并建立間接ELISA 法來檢測牛乳，不僅有較高的特異性，靈敏度為5 μg/mL。ELISA 檢測方法特異性高，結果準確可靠，但該方法耗時，不適用在現(xiàn)場檢測。本試驗是以牛β-lg 為抗原制備單克隆抗體，并研制膠體金免疫層析試紙條，靈敏度是3.13 μg/mL。該方法提高了檢測的靈敏度和準確性，更適用于現(xiàn)場檢測。

圖8 β-lg 快速檢測試紙條的靈敏度Fig.8 Detection limit of β-lg rapid test strip

表2 試紙條反應性檢測的結果Table 2 The reactivity test results of the strip

2.4 試紙條特異性試驗

圖9 β-lg 快速檢測試紙條的特異性Fig.9 Specificity of β-lg rapid test strip

用該試紙條檢測其他蛋白溶液，結果如圖9 和表3。由表3 和圖9 可知，檢測β-lg 溶液的試紙條T 線不顯色，其他五種蛋白溶液的檢測試紙條T 線均有顏色。這是因為β-lg 溶液中的抗原與金標抗體發(fā)生反應，形成金標抗體抗原復合物，移至NC 膜檢測線T 上時，T 線上的抗原表位沒有與抗體結合。其他五種蛋白溶液的檢測線上有顏色是因為溶液中的蛋白抗原沒有與抗體發(fā)生反應，當金標抗體經(jīng)過NC 膜上T 線時，金標抗體被固定下來，膠體金顆粒發(fā)生聚集，在T 線上顯色紅色條帶。說明該試紙條對β-lg 有良好的特異性。

表3 試紙條特異性檢測Table 3 Test strip specificity

2.5 間接ELISA 法檢測脫脂牛羊乳混合樣品

圖10 脫脂牛羊乳混合樣品的吸光值Fig.10 Absorbance value of mixed sample of skim cow and goat milk

如圖10 所示，把不同體積分數(shù)的牛乳摻入脫脂羊乳中，隨著摻入牛乳體積分數(shù)的增大，吸光值在逐漸增大，原因是牛乳蛋白質在ELISA 板上吸附牢固，不易被洗掉，可以與抗體發(fā)生反應的蛋白抗原多，吸光值升高；當摻入量增加到40%以上后，吸光度在逐漸減小，是因為牛乳蛋白質含量太高，在包被過程中，形成多層吸附，在洗板時，ELISA 板上的蛋白質大都被洗掉，能與抗體發(fā)生反應的蛋白抗原減少，吸光值降低。

2.6 競爭法試紙條檢測脫脂牛羊乳混合樣品

由圖11 和表4 可知，隨著牛乳摻入量的增加，NC 膜上T 線的顏色由深變淺，再到看不見。加入1%脫脂牛乳時，NC 膜T 線顏色清晰；加入2%牛乳時，NC 膜上C 線的顏色變淡；可以檢測出羊乳中摻假的牛乳。當加入的牛乳量大于5%時，NC 膜上T 線不顯色，這是因為加入牛乳的量增多時，能和抗體反應的抗原多，可以與T 線上的抗原反應的金標抗體減少了，顏色就會變淺直至沒有。所以脫脂羊乳中加入5%的脫脂牛乳是該試紙條的最小檢測限。

圖11 牛羊乳摻假檢測Fig.11 Detection of milk adulteration

表4 牛羊乳摻假檢測Table 4 Detection of milk adulteration

Bulent 等[20]以牛IgG 為抗原，獲得特異性高，與羊乳交叉反應小的單克隆抗體，并研制了膠體金免疫層析試紙條，該法可準確檢出樣品中牛乳IgG 含量，確定牛乳IgG 的最小檢測濃度為60.5 μg/mL。張歡等[21]以牛β-lg 為研究對象，建立了競爭性免疫層析法，并檢測了羊乳中乳蛋白含量，可在3～10 min 內出結果，得出最低檢出限為2%。本試驗以牛β-lg 為抗原制備高特異性單克隆抗體，并建立競爭性免疫層析法，檢測了羊乳中牛β-lg 含量，得出最低檢測限為5%。

2.7 市售羊乳制品的摻假結果

圖12 羊乳制品的檢測Fig. 12 Detection of sheep milk products

用試紙條檢測采買的羊乳及其制品。檢測結果見圖12。結果顯示7 個樣品中，4 個顯示陽性，表明這些樣品均有牛乳蛋白成分。同時，用牛乳蛋白ELISA試劑盒檢測，兩種檢測方法結果一致（表5），表明本方法結果準確可靠。3 個陰性樣本，配料表上標注了“生羊乳，羊奶粉”，而陽性樣本配料表上均未表明乳清蛋白的動物來源，只標注“脫鹽乳清粉”。故陽性樣本中的蛋白可能來自“脫鹽乳清粉或濃縮乳清蛋白粉”。該試紙條檢測實際樣品的結果表明，它可以應用在羊乳及其制品的現(xiàn)場快速檢測。

表5 免疫層析法和ELISA 檢測結果的比較Table 5 Comparison of immunochromatography and ELISA results

3 結論

本試驗根據(jù)半固體培養(yǎng)基的方法來進行雜交瘤細胞的融合，篩選了6 株雜交瘤陽性細胞株，對其進行培養(yǎng)，腹腔法來獲得單克隆抗體，并對單克隆抗體的特性進行鑒定，最后得到了純度高達90%，效價都在10000 以上，且特異性很高。研制了可快速檢測牛β-lg的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條成本低廉，穩(wěn)定性良好，檢測范圍廣，樣品前處理簡單，點樣后5 min后裸眼即可判定結果，對β-lg的LOD值是3.13 μg/mL，脫脂羊乳中摻假脫脂牛乳的LOD 值是0.5%。通過對市售羊乳制品檢測，結果和商品化ELISA 試劑盒一致，故本試驗研制的免疫層析試紙條可用于摻雜牛乳的羊乳及其制品的現(xiàn)場快速篩查。