史穎珠，侯建波，謝文，錢艷，黃超群，張雅琴，劉翠平，張輝

（1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州 310058）

（2.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310016）（3.浙江省檢驗檢疫科學技術(shù)研究院，浙江杭州 310016）

山銀花是從忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.，華南忍冬Lonicera confusaDC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C. Cheng 的干燥花蕾或帶初開的花，并在夏初花開放前采收獲得，自《中國藥典》2005 年版起，與金銀花進行區(qū)分。具有清熱解毒，疏散風熱的功效，可用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。也具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗動脈粥樣硬化等作用[2-5]。因此，2014 年正式被國家衛(wèi)生計生委批準為“按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)”[6,7]。

圖1 有機酸和黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structures of investigated organic acids and flavonoids

研究發(fā)現(xiàn)山銀花的有效成分除綠原酸，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙外，還有黃酮類化合物、揮發(fā)油類化合物、有機酸類和三萜類化合物[8-12]，研究人員通過HPLC，LC-MS/MS、高分辨質(zhì)譜法和波譜學等方法來測定和鑒別山銀花中各成分的結(jié)構(gòu)和含量[13-15]，以及開展指紋圖譜、產(chǎn)品和品種的鑒別研究[16-20]。目前已發(fā)表的分析方法中除高分辨質(zhì)譜儀檢測可一次性篩查出山銀花中較多的有效成分外，其他檢測均較難獲得很多有效成分信息。但高分辨質(zhì)譜儀價格昂貴，影響了它的應用范圍。本文通過文獻調(diào)研篩選出山銀花中4 種主要有機酸和14 種黃酮類化合物，采用酸性甲醇溶液超聲提取，HLB 固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，建立了如圖1 所示的山銀花中綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮素、蘆丁、木犀草素、木犀草苷、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆樹苷、黃芩素、黃芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香葉木素、白楊素和山奈素含量測定的方法，實現(xiàn)了山銀花中主要的4種有機酸和14種黃酮類化合物含量的同時測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設備

API 4000 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源ESI，AB 公司，美國）；1100 型液相色譜儀（Agilent公司，美國）；Milli-Q Synergy 185 超純水器（Millipore公司，美國）；IKA MS3 Basic 型渦旋器（IKA 公司，德國）；24 孔固相萃取裝置（Supelco 公司，美國）；Heraeus Multifuge X1R 型臺式離心機（Thermo 公司，美國）；P 300 H 型超聲波清洗機（Elma 公司，德國）；G&G JJ500 型電子天平（雙杰公司產(chǎn)品，中國）；Mettler AE260 型電子天平（Mettler Toledo 公司產(chǎn)品，瑞士）。

1.1.2 主要耗材和試劑

甲醇（色譜純），Tedia 公司；甲酸（質(zhì)譜級），Scharlau 公司；乙腈（色譜純），Scharlau 公司；鹽酸（優(yōu)級醇），永華化學科技（江蘇）有限公司；叔丁基對苯二酚（tert-Butylhydroquinone，簡稱：TBHQ，分析純），Aladdin 公司；L-(+)-抗壞血酸（L(+)-Ascorbic acid，分析純），廣東光華科技股份有限公司；CNW C18固相萃取柱（6 mL，500 mg），Anpel 公司；Waters HLB 固相萃取柱（6 mL，200 mg），Waters 公司。

標準物質(zhì)：綠原酸（純度99.9%），ANPEL 公司；咖啡酸（純度98.1%），ANPEL 公司；異綠原酸A（純度98.8%），ANPEL 公司；異綠原酸C（純度99.5%），ANPEL 公司；槲皮素（純度96.4%），ChromaDex公司；蘆?。兌?5.0%），TRC 公司；木犀草素（純度96.9%），ChromaDex 公司；木犀草苷（純度98.9%），ANPEL 公司；山萘酚（純度95.5%），中國食品藥品檢定研究院、紫云英苷（純度99.1%），ANPEL 公司；芹菜素（純度98.5%），Bepure 公司；野漆樹苷（純度98.9%），ANPEL 公司；黃芩素（純度99.2%），ANPEL 公司；黃芩苷（純度96.8%），ChromaDex公司；槲皮素-3-甲基醚（純度97.0%），TRC 公司；香葉木素（純度97.8%），ChromaDex 公司；白楊素（純度98.0%），TRC 公司；山奈素（純度97.8%），ChromaDex 公司。用甲醇將各化合物固體標準品溶解，稀釋并定容獲得10 mg/mL 標準儲備液，根據(jù)需要用甲醇將其儲備液稀釋至所需濃度。

1.1.3 儀器工作條件

色譜參數(shù)：色譜柱：Mightysil RP-18，3 μm，4.6×150 mm，流動相：甲醇（A）-0.15%甲酸溶液（B），流動相梯度洗脫程序：0～10.0 min時40%（A）線性增加至75%；10.0～15.0 min時75%（A）線性增加至90%；15.0～22.0 min時90%（A）保持不變；22.0～23.0 min線性下降至40%（A）；23.0～30.0 min 40%（A）進行系統(tǒng)平衡；流速：0.4 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫25 ℃。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：負離子掃描；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化氣壓力（GS1）：289 kPa（42 psi）；氣簾氣壓力（GS2）：310 kPa（45 psi）；輔助氣流速（CUR）：172 kPa（25 psi）；離子源溫度（TEM）：540 ℃，駐留時間30 ms；其它質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 各化合物基本信息及質(zhì)譜測定條件Table 1 Standard information and optimized mass spectrometric parameters of compounds

1.1.4 試驗方法

稱取0.5 g 試樣（精確到0.01 g）置于50 mL 具塞離心管中，加0.5 g TBHQ，加入40 mL 50%的甲醇溶液，渦旋均勻，超聲40 min（100 W，37 kHz，30 ℃），靜置冷卻至室溫后，于8500 r/min 高速離心5 min，濾紙過濾上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加水定容至50 mL，混勻，取1 mL 加8.5 mL 水和0.5 mL 濃鹽酸，渦旋混勻并轉(zhuǎn)移至HLB 固相萃取柱中（依次用5 mL甲醇和5 mL 5%甲醇溶液活化），加入5 mL 5%甲醇溶液淋洗，抽干，加10 mL 甲醇進行洗脫，控制流速1～2 mL/min，收集全部洗脫液，定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm 有機濾膜，取1.0 mL 定容溶液，加40%的甲醇溶液稀釋定容至25 mL，混合均勻，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2 數(shù)據(jù)處理

標準溶液和實驗溶液通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測試，以標準品峰面積Y 為縱坐標，以待測物質(zhì)量濃度X（g/kg）為橫坐標對標準溶液繪制標準工作曲線，并對實驗溶液進行定量計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

本試驗參考中國藥典的方法[1]，采用超聲方式進行提取，并考察了超聲波清洗儀參數(shù)、抗氧化劑對提取情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲頻率在37 kHz 和80 kHz，有效功率100 W，對提取結(jié)果顯示無明顯差別。比較超聲時間在10、20、30、40、50、60 min 的提取情況，在40 min 時的回收率最高，當超聲時間大于40 min 后，山銀花本底中的綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A 和異綠原酸C 含量，和通過外部添加方式加入的黃芩素和黃芩苷回收率下降10%～15%。對比TBHQ和抗壞血酸兩種不同抗氧化劑的保護情況，結(jié)果表明，在沒有抗氧化劑的情況下，山萘酚的回收率低于70%，在TBHQ加入后，山萘酚的回收率可以達到80%以上，山奈素回收率提高約10%。綜上情況，最終選擇超聲頻率37 kHz，有效功率100 W，超聲時間40 min，50%甲醇溶液，TBHQ 保護下開展提取實驗。

2.2 凈化條件的選擇

本試驗考察了C18和HLB 兩種類型固相萃取柱的凈化情況，以降低基質(zhì)效應對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量測定的基質(zhì)干擾，提高檢測結(jié)果的準確性。取1 mL 200 ng/mL 的標準溶液（50%甲醇溶液，0.5 g TBHQ），加入9 mL 水，考察鹽酸濃度分別為0%、2.5%、5%、10%、15%的凈化情況，混勻上樣后，采取5 mL 的10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液進行淋洗和10 mL 甲醇進行洗脫。結(jié)果如圖2 所示，酸性環(huán)境有助于提高固相萃取凈化時化合物的穩(wěn)定性，不加鹽酸時蘆丁、木犀草素、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆樹苷、黃芩素、槲皮素-3-甲基醚和香葉木素的凈化回收率均低于含有鹽酸的情況，對不同濃度的鹽酸考察發(fā)現(xiàn)，鹽酸濃度5%時化合物回收率整體較好。淋洗實驗發(fā)現(xiàn)，在甲醇含量為20%時，在C18固相萃取柱中綠原酸和咖啡酸會被洗脫，在HLB 固相萃取柱中，甲醇含量大于30%時綠原酸和咖啡酸會被洗脫，HLB固相萃取柱的凈化回收率和穩(wěn)定性好于C18固相萃取柱。因此試驗采用HLB 固相萃取柱，甲醇溶液上樣（含有5%鹽酸），5%甲醇淋洗，甲醇洗脫的方式進行凈化。

圖2 不同鹽酸濃度在HLB 固相萃取柱中的凈化情況對比圖Fig.2 The results of different HCl concentrations in HLB solid phase extraction columns

2.3 色譜條件的考察

實驗對比Mightysil RP-18，3 μm，4.6×150 mm 或Inertsil ODS-3，3 μm，4.6×150 mm 色譜柱，甲醇或乙腈為有機相，0.15%甲酸溶液或水為水相對目標化合物進行分離情況。結(jié)果表明，相同色譜條件下，綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C 在Mightysil RP-18 的分離效果好于Inertsil ODS-3，黃芩苷在Mightysil RP-18 為分離柱時譜峰峰形更好，信號提升約4 倍。因此采用Mightysil RP-18 為分離柱對目標化合物進行分析。在相同色譜柱和流動相梯度洗脫程序下，甲醇為有機相時大部分化合物的信號響應和峰形好于乙腈有機相（其中野漆樹苷、蘆丁、木犀草苷在甲醇為流動相時信號響應提升3～5 倍），綜合考慮前處理采用甲醇進行洗脫凈化，因此采用甲醇為有機相對目標化合物進行分離。對比相同色譜柱下甲醇為有機相，水和0.15%甲酸溶液為水相的分離情況，以Mightysil RP-18 色譜柱為例，在0.15%甲酸溶液中信號的峰形和響應好于水（其中綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C 和黃芩素在含0.15%甲酸時信號提升5 倍以上）。綜上情況，實驗以Mightysil RP-18為分離柱，甲醇和0.15%甲酸溶液為流動相，分析結(jié)果如圖3 所示，該條件下相近離子對的化合物如異綠原酸A 和異綠原酸C，山奈素和香葉木素可以實現(xiàn)很好的分離。

2.4 質(zhì)譜條件的考察

實驗采用流動注射的方式在負離子模式下進行母離子全掃描獲得準分子離子峰，再以準分子離子峰為母離子，對其子離子進行全掃描。按照歐盟EC/657指令和《質(zhì)譜分析方法通則》的要求，選擇兩個特征子離子對目標化合物定量確證，以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對。多反應監(jiān)測負離子模式下優(yōu)化的各質(zhì)譜參數(shù)和最佳質(zhì)譜條件參見表1。

圖3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法分離結(jié)果（2 ng/mL）Fig.3 The separation result of LC-MS/MS

2.5 基質(zhì)效應的考察

試驗通過計算離子抑制率的方式來考察基質(zhì)效應情況[21]。[離子抑制率/%=（溶劑工作液中響應強度-基質(zhì)加標溶液響應強度）×100%/溶劑工作液中響應強度]。測試相同濃度（40 ng/mL）的溶劑工作液和基質(zhì)加標溶液中各化合物的信號響應強度，如表2 所示，各化合物離子抑制率均小于15%，即試驗條件下獲得的基質(zhì)溶液無明顯的基質(zhì)效應，因此采用甲醇-0.15%甲酸溶液（體積比4:6）稀釋獲得線性工作曲線溶液進行定量計算。

2.6 方法的線性關(guān)系，定量限和回收率實驗

在確定實驗條件下進行檢測，方法定量限（以S/N＞10 計）0.005 g/kg（槲皮素、蘆丁、木犀草苷、紫云英苷、芹菜素、黃芩苷和槲皮素-3-甲基醚），0.025 g/kg（木犀草素、野漆樹苷、香葉木素和山奈素）和0.05 g/kg（綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C、山奈酚、黃芩素和白楊素）。對濃度0.05、0.10、0.20、0.50 和1.00 g/kg 的線性工作曲線溶液進行測試，以標準品峰面積Y 為縱坐標，以待測物質(zhì)量濃度X（g/kg）為橫坐標繪制標準工作曲線如表3 所示，線性方程的相關(guān)系數(shù)r2大于0.993。

表2 山銀花基質(zhì)對各化合物的基質(zhì)效應情況Table 2 The matrix effect of Lonicerae flos on the investigated compounds (n=3)

表3 待測化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 The linear equation and correlation coefficients (r2) of compounds

表4 山銀花中3 個水平下的加標回收率和相對標準偏差Table 4 The results of recoveries and correlation coefficients (n=6)

注：回收率=（測定結(jié)果-空白值）/添加濃度×100%。

表5 山銀花中有機酸和黃銅類化合物含量測定結(jié)果Table 5 The contents of organic acid and flavonoids in Lonicerae flos

對山銀花樣品（樣品含綠原酸21.0 g/kg，咖啡酸1.50 g/kg，異綠原酸A 11.2 g/kg，異綠原酸C 10.3 g/kg），進行3 個濃度水平的添加回收實驗（添加水平綠原酸10.0、20.0 和40.0 g/kg，咖啡酸1.0、2.0 和4.0 g/kg，異綠原酸A 和異綠原酸C 5.0、10.0 和20.0 g/kg，其他化合物0.05、0.10 和0.20 g/kg），每個濃度水平取6 個平行樣。測定綠原酸，咖啡酸，異綠原酸A 和異綠原酸C 時，將測試溶液進行稀釋至溶液濃度在線性范圍內(nèi)。結(jié)果如表4 所示，采用外標法定量，方法總體回收率69.2%～116%，相對標準偏差：3.3%～12.0%。

2.7 實際樣品測試

應用實驗方法對11 個山銀花進行檢測，結(jié)果如表5 所示，山銀花中綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C的含量最高，其次是木犀草苷和紫云英苷。樣品中有8 個化合物（山奈酚、野漆樹苷、黃芩素、黃芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香葉木素、白楊素和山奈素）含量低于方法定量限。

3 結(jié)論

本試驗通過甲醇溶液超聲提取，酸性溶液上樣，HLB 固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，外標法定量，實現(xiàn)了對山銀花中18 種主要有機酸和黃酮類化合物（綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮素、蘆丁、木犀草素、木犀草苷、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆樹苷、黃芩素、黃芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香葉木素、白楊素和山奈素）含量的測定。對11 個山銀花樣品的測定結(jié)果顯示綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷和紫云英苷是其主要成分。研究結(jié)果對后續(xù)分析各化合物含量與藥物活性關(guān)系，山銀花品質(zhì)和品種研究具有重要的輔助作用。