孫良旭 彭利軍 郭安兵 張艷青 魯 臨 吉布席

1.山東第一醫(yī)科大學研究生部 山東省醫(yī)學科學院，山東濟南 250062；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院消化內科，山東臨沂 276000

胃癌是源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)病率、死亡率均位于世界癌癥發(fā)病率和死亡率前列[1]。東亞地區(qū)尤以我國更是胃癌高發(fā)地區(qū)[2-3]，其早發(fā)現(xiàn)、早診斷具有重要意義[4]。近年來關于DNA 甲基化在胃癌發(fā)病與預警方面的研究成為熱點[5-8]。Asada 等[9-10]研究顯示，胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平與異時性胃癌發(fā)生風險相關，但這些基因與胃癌癌前疾病的臨床及病理特征之間的關系尚未充分研究。本研究旨在通過對胃癌及其癌前疾病組織行EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平檢測，探究其基因甲基化與慢性胃炎萎縮、腸化、癌變等內鏡及病理特征的相關性，進一步探討DNA 甲基化在胃癌早診早治中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年6 月—2020 年2 月于山東省臨沂市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）內鏡中心行胃鏡及病理檢查的192 例患者作為研究對象。納入標準：①經我院醫(yī)學倫理委員會批準；②患者許可并簽署知情同意書；③符合慢性胃炎、胃癌診斷標準[3,11]。排除標準：①合并其他良、惡性腫瘤及嚴重基礎疾?。虎谠形覆壳谐中g；③使用對研究造成影響的藥物，如甲基化抑制劑等。

依據(jù)胃癌的發(fā)展模式（Correa 級聯(lián)），將患者分為慢性非萎縮性胃炎組（95 例）、慢性萎縮性胃炎組（86 例）和胃癌組（11 例）；其中慢性非萎縮性胃炎組男61 例，女34 例；年齡27～81 歲，平均（57±11）歲。慢性萎縮性胃炎組男63 例，女23 例；年齡29～83 歲，平均（61±10）歲。胃癌組男7 例，女4 例；年齡37～87 歲，平均（64±14）歲。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 疾病診斷標準

慢性胃炎：符合《中國慢性胃炎共識意見》（2017 年，上海）[11]。胃癌：符合《胃癌診療規(guī)范》（2018 年版）[3]。萎縮、腸化：符合《慢性胃炎及上皮性腫瘤胃黏膜活檢病理診斷共識》[12]。

依據(jù)慢性胃炎不同萎縮程度（病理）分為低萎縮組（無、輕度，104 例）、高萎縮組（中、重度，77 例）；依據(jù)慢性萎縮性胃炎腸化程度分為低度腸化組（無、輕度，31 例）、高度腸化組（中、重度，55 例）；根據(jù)內鏡下慢性萎縮性胃炎木村-竹本分類[13]分為低度萎縮組（C1，局限胃竇，24 例）、中度萎縮組（C2、C3，過胃竇、未達賁門，48 例）、高度萎縮組（O1、O2、O3，已達賁門，14 例）。

1.3 方法

1.3.1 標本收集與隊列完善 標本收集，胃鏡診療（電子胃鏡GIF-H260、H290，OLYMPUS）、病理診斷（10%福爾馬林固定）及甲基化測定（液氮、-80℃冰箱存放）規(guī)范進行。

1.3.2 基因甲基化測定 對胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因啟動子CPG 島區(qū)域相關位點（基因組位置國際編碼72920408～72920771、63178334～63178525、84496817～84497022）甲基化水平進行測定。通過多重PCR 技術擴增目的片段，結合二代測序平臺，對PCR產物進行測序，檢測目標區(qū)域甲基化狀態(tài)，計算不同位點甲基化水平（百分比）。實驗流程：DNA 提取[DNA提取試劑盒（Tiangen，上海松茸生物科技有限公司）]，重點在DNA 純度。亞硫酸鹽處理[重亞硫酸鹽轉化試劑盒（DP215，凱杰生物有限公司）]。目標區(qū)域引物設計：EMX （上游：5’-GGAAATTCGTTGGGTATTGAAGG-3’、下游：5’-GACCTTCGAAATCCTAAACGATTC-3’）；miR-124a-3（上游：5’-GAAAGGGGAGAAGTGTGGG-3’、下游：5’-AAATCAAAATCCGCTATAAACACG-3’）；NKX6-1（上游：5’-GGGAAGTGAGTGTATTTGTATGTAC-3’，下游：5’-ACTCCACGATATCCCCAAATATAC-3’）。甲基化位點PCR 捕獲[多重PCR 擴增，特異性工作液對質控品PCR 檢測，產物電泳檢測（3%瓊脂糖凝膠）]，樣本添加Index，上機測序（Illumina X-10 測序（Read1 測序、雜交Index 引物、Index 測序，Paired End Turnround、合成Read1 互補鏈，雜交Read2 引物、Read2 測序）等[PCR 儀（A-100、杭州朗基儀器公司），電泳儀（JY600+、北京君意東方電泳公司）。PCR 引物（PAGE 純化、上海百力格公司），dNTP（promega、上海有漁生物工程公司）]。由上海翼和應用生物技術有限公司支持。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示表示，多組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗分析，兩組間比較用Mann-Whitney U 檢驗分析，有顯著性差異的兩兩比較用Bonferroni 法分析；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組不同位點甲基化水平比較

三組EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位點甲基化水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。慢性萎縮性胃炎組EMX1 基因（72920455、72920466、72920469）與miR-124a-3 基因（63178433、63178444、63178452）位點甲基化水平高于慢性非萎縮性胃炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。胃癌組NKX6-1 基因（84496988、84496933、84496882、84496840）位點甲基化水平低于慢性非萎縮性胃炎組及慢性萎縮性胃炎組；慢性萎縮性胃炎組NKX6-1基因（84496988、84496933、84496882、84496840）位點甲基化水平高于慢性非萎縮性胃炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

2.2 慢性胃炎不同萎縮程度（病理）組甲基化水平比較

高萎縮組EMX1 基因（72920466、72920469、7292 0484），miR-124a-3 基因（63178433、63178452、63178 485）與NKX6-1 基因（84497016、84496979、84496975）位點甲基化水平高于低萎縮組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表2。

2.3 慢性萎縮性胃炎不同腸化程度組甲基化水平比較

高度腸化組EMX1 基因（72920455、72920466、72920469），miR-124a-3 基因（63178334、63178377、63178433）與NKX6-1 基因（84497016、84496979、844 96975）位點甲基化水平高于低度腸化組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

表1 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組不同位點甲基化水平比較[M（P25，P75）]

表2 慢性胃炎不同萎縮程度（病理）組甲基化水平比較[M（P25，P75）]

表3 慢性萎縮性胃炎不同腸化程度組甲基化水平比較[M（P25，P75）]

2.4 慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度（內鏡）組甲基化水平比較

慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度（內鏡）組EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位點甲基化水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。高度萎縮組EMX1 基因（72920581、72920627、72920639）位點甲基化水平高于低度萎縮組和中度萎縮組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。高度萎縮組miR-124a-3 基因（63178345、63178383、63178444）與NKX6-1 基因（84496965、84496893、84496884）位點甲基化水平高于低度萎縮組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表4。

3 討論

胃癌多數(shù)是在癌前變化基礎上發(fā)生，癌前變化分癌前疾病和癌前病變。目前對基因甲基化與胃癌狀態(tài)的研究較多[14-17]，近年已有關于應用DNA 甲基化預測胃部疾病進展[18-20]、胃癌風險分層的DNA 甲基化積累及標記的相關報道[21-22]，并且近期相關研究[23]顯示，血液中檢測DNA 甲基化可比常規(guī)診斷提前4 年發(fā)現(xiàn)癌癥（包括胃癌），但關于基因異常甲基化與胃癌癌前疾病的相關性仍需進一步探究。研究顯示[9-10]，胃組織EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平可預測異時性胃癌發(fā)生風險，但缺乏與臨床指標的關聯(lián)性研究，本研究將進一步探討這些基因甲基化在胃癌癌前疾病中的意義。

本研究結果顯示，胃組織在胃癌癌前變化的不同狀態(tài)中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因的甲基化水平有明顯差異。慢性萎縮性胃炎甲基化水平明顯高于慢性非萎縮性胃炎（P ＜0.05）；而無論是在慢性胃炎（病理分級）不同萎縮程度、慢性萎縮性胃炎（內鏡分級）不同萎縮程度，還是在慢性萎縮性胃炎不同腸化程度的甲基化水平差異比較中，均表現(xiàn)為病情越嚴重狀態(tài)的甲基化水平越高。提示胃癌癌前疾病在EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因上存在甲基化水平積累現(xiàn)象，即“慢性非萎縮性炎癥→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→胃癌”[24]演變過程中，胃癌癌前疾病相關病情越重，甲基化水平越高，提示EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎縮及腸化的進展過程中發(fā)揮重要作用，值得進一步研究。而在胃癌組織中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平未見明顯升高，NKX6-1 基因甲基化水平甚至低于慢性非萎縮性胃炎與慢性萎縮性胃炎，提示癌癥組織中甲基化水平有下降的趨勢。研究顯示[25]，NKX6-1 基因的甲基化可作為結直腸癌患者化療效果的預測因子。

表4 慢性萎縮性胃炎不同萎縮程度（內鏡）組甲基化水平比較[M（P25，P75）]

本研究主要以研究胃癌癌前疾病為主，胃癌標本量相對不足，有一定局限性，其關于胃癌組織中甲基化水平有下降趨勢的結果是否有代表性尚需進一步探究，目前缺乏深入的機制性研究。

綜上所述，EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 三個基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎縮及腸化的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但其具體機制仍有待進一步深入探究。