趙國(guó)有 林瀅 于維森

(青島市疾病預(yù)防控制中心 山東青島266033)

1 前言

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)具有敏感度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、適合大批量標(biāo)本檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前在很多領(lǐng)域都得到廣泛應(yīng)用。但該方法操作步驟較多，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響因素較多，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員、儀器設(shè)備、試劑等有較高要求，操作步驟若不規(guī)范會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生極大影響[1]。本文利用不確定度來源分析的理念[2-3]，對(duì)ELISA測(cè)定中的不確定度來源進(jìn)行歸納與分析，確定影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的主要因素，并采取合適的措施和規(guī)范的操作，將其對(duì)結(jié)果的影響控制在可接受的水平。

2 確定ELISA試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不確定度來源

ELISA檢測(cè)過程中，主要的環(huán)節(jié)包括樣品制備、試劑的選擇、加樣、溫育、計(jì)時(shí)、洗板、酶標(biāo)儀測(cè)量、結(jié)果計(jì)算等。

按照測(cè)量不確定度來源分析的理念，針對(duì)ELISA檢測(cè)的操作環(huán)節(jié)，對(duì)ELISA測(cè)定中不確定度的來源進(jìn)行分析。

2.1 A類不確定度因素

A類不確定度影響因素包括(但可能不限于)對(duì)被稀釋后的被檢血清或抗原的每個(gè)濃度進(jìn)行的多個(gè)平行進(jìn)檢測(cè)引起的不確定度、不同人員之間不同檢測(cè)同一樣品引起的測(cè)量不確定度、標(biāo)準(zhǔn)樣品引起的不確定度、不同品牌試劑用于同一血清進(jìn)行引起的不確定度、被檢樣品/試劑盒存放條件引起的不確定度、采樣是否正確及樣品是否被污染引起的不確定度、樣品運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件引起的不確定度、處理樣品引起的不確定度、環(huán)境條件引起的不確定度、設(shè)備因素引起的不確定度、未知的隨機(jī)因素引起的不確定度。

2.2 B類不確定度影響因素

B類不確定度因素因素包括(但可能不限于)酶標(biāo)儀的分辨力、孵育所用的恒溫箱溫度、加樣器、天平、未知隨機(jī)因素(如設(shè)備供電是否穩(wěn)定、環(huán)境溫度是否變化很大、試劑反復(fù)冷藏、人員身體狀況等等)。

3 不確定度來源分析及相應(yīng)控制措施

通過分析ELISA測(cè)定中不確定度的來源，根據(jù)檢測(cè)的方法原理發(fā)現(xiàn)，影響ELISA結(jié)果不確定度的因素分布在ELISA試驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，主要有標(biāo)本、試劑、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作因素及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等方面。通過對(duì)這些因素的良好控制，可盡可能縮小由這些因素帶來的檢測(cè)結(jié)果的不確定性。

3.1 標(biāo)本

合格的標(biāo)本是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提，標(biāo)本中的內(nèi)源性和外源性因素都可能干擾檢測(cè)。對(duì)可能含有類風(fēng)濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白等內(nèi)源性干擾因素的標(biāo)本建議按照試劑盒說明書的要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)處理，如對(duì)標(biāo)本應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，在56℃下進(jìn)行滅活(30 min)[4]。

在標(biāo)本接收時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)收，排除不合格的標(biāo)本。以血清標(biāo)本為例，血液標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送等環(huán)節(jié)操作不當(dāng)所造成的標(biāo)本溶血、污染、長(zhǎng)時(shí)間貯存、加入抗凝物質(zhì)等都可能產(chǎn)生一些外源性物質(zhì)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。因而血液采集后不可劇烈震蕩，避免溶血，因血紅蛋白具有類過氧化物活性，可催化底物顯色；同時(shí)樣本收集過程中盡量防止細(xì)菌污染，避免細(xì)菌可能分泌酶及內(nèi)源性H R P等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；標(biāo)本采集后，應(yīng)在血液充分凝固后再分離血清，避免纖維蛋白原非特異性吸附對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響；標(biāo)本盡量及時(shí)檢測(cè)，不能及時(shí)檢測(cè)的應(yīng)冷凍保存，并且不要反復(fù)凍融，避免破壞蛋白分子結(jié)構(gòu)。加入抗凝物質(zhì)到標(biāo)本中時(shí)，盡可能不使用酶抑制劑，避免ELISA中的酶活性降低[5]。

3.2 試劑

試劑是影響檢測(cè)結(jié)果的一個(gè)重要因素，試劑的質(zhì)量直接決定了檢測(cè)的質(zhì)量。因此實(shí)驗(yàn)室必須通過嚴(yán)格的評(píng)估，根據(jù)檢測(cè)目的選擇和訂購(gòu)質(zhì)量穩(wěn)定、可靠的試劑，并保證保存條件。試劑在使用過程中的不規(guī)范也會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，造成結(jié)果偏差。如使用過期試劑，不同廠家或不同批號(hào)試劑盒組分混用；試劑質(zhì)量不合格等[6]。因此，在試劑盒使用的過程中，應(yīng)嚴(yán)格遵照試劑盒說明書的要求操作。在實(shí)驗(yàn)之前要從冰箱將試劑盒拿出平衡到室溫，避免對(duì)抗原抗體結(jié)合和反應(yīng)速度造成影響[7]。嚴(yán)格按照試劑盒要求設(shè)立內(nèi)部對(duì)照，不能隨意減少，同時(shí)最好也設(shè)外部對(duì)照，通過內(nèi)部對(duì)照和外部對(duì)照判定試驗(yàn)的有效性，如果無效，需分析原因，重新試驗(yàn)。

3.3 儀器設(shè)備

ELISA測(cè)定中使用的主要儀器設(shè)備包括微量加液器、酶標(biāo)洗板機(jī)、恒溫箱或水浴箱、酶標(biāo)儀等。應(yīng)選擇質(zhì)量好、精度高的微量加液器，定期對(duì)加液器進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)；使用水浴箱時(shí)應(yīng)注意溫度調(diào)控精度，保持水位和水質(zhì)清潔；應(yīng)選擇分液精度高、均一性好，殘液量小的洗板機(jī)，尤其要注意洗板機(jī)的日常維護(hù)，以防止管道堵塞和腐蝕，洗板時(shí)應(yīng)注意觀察，避免洗板機(jī)管道或洗板針阻塞等引起的洗板不夠徹底而對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；酶標(biāo)儀是測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的重要設(shè)備，每年應(yīng)進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)，使用前先預(yù)熱儀器15～30 min，設(shè)備運(yùn)行穩(wěn)定后再進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)應(yīng)按照試劑盒的要求選擇合適的波長(zhǎng)，平時(shí)注意酶標(biāo)儀的日常維護(hù)，防止濾光片霉斑等對(duì)檢測(cè)的影響。

3.4 實(shí)驗(yàn)操作因素

3.4.1 加樣

加樣是ELISA檢測(cè)的重要步驟，其精度會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果，除選擇高質(zhì)量合適量程的微量移液器外，正確使用移液器也是非常重要的。加樣前應(yīng)首先檢查移液器，如發(fā)現(xiàn)體積不足，應(yīng)更換合格的移液器。使用時(shí)應(yīng)選用合適的高質(zhì)量槍頭并安裝嚴(yán)密，避免吸入、打出的體積不準(zhǔn)確。在加樣時(shí)吸頭應(yīng)避免碰觸包被的抗原，加試劑前，應(yīng)先將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次使液體混勻。吸取不同試劑、不同標(biāo)品時(shí)應(yīng)更換槍頭，避免交叉污染。加樣時(shí)試驗(yàn)人員應(yīng)當(dāng)精神集中，尤其標(biāo)本較多時(shí)，避免漏加、誤加等低端錯(cuò)誤，最好加樣前先編制加樣藍(lán)圖，對(duì)照加樣圖小心加入。加樣過程中的錯(cuò)加、漏加試劑，或加量不足、順序顛倒，或加樣時(shí)間過長(zhǎng)，加樣后未混勻等都會(huì)對(duì)檢測(cè)有很大影響。

3.4.2 孵育

在ELISA法檢測(cè)中，孵育對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響。我國(guó)目前大部分ELISA試劑盒檢測(cè)為兩步法，需要兩次孵育。在孵育過程中，需要控制2個(gè)指標(biāo)：孵育溫度、孵育時(shí)間。在孵育時(shí)要嚴(yán)格執(zhí)行說明書的要求，不可隨意更改溫度和時(shí)間。常用孵育方式有溫箱法、水浴法等，為避免恒溫箱或水浴箱面板顯示的溫度與實(shí)際不符，應(yīng)在箱內(nèi)使用校準(zhǔn)后的溫度計(jì)，并以箱內(nèi)溫度計(jì)為準(zhǔn)。溫箱法孵育過程需要經(jīng)過一定時(shí)間方可達(dá)到平衡點(diǎn)[8]，而且可能存在酶標(biāo)板受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異(即邊緣效應(yīng))。水浴法能較好解決因受熱不均衡的問題。因此孵育通常采用的是水育法，孵育時(shí)應(yīng)注意板條不能疊加放置，應(yīng)按要求貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)。應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求控制時(shí)間，不要隨意延長(zhǎng)或縮短。這些情況會(huì)出現(xiàn)顯色弱(高)、靈敏度低(高)、重復(fù)性差等。

3.4.3 洗板

采用ELISA法檢測(cè)過程中，要進(jìn)行多次洗板。通過洗板，除去未被結(jié)合的抗原、抗體或結(jié)合物，是十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。洗板是否徹底對(duì)檢測(cè)結(jié)果有直接影響。在該步驟中，洗滌液的配制應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行，不可隨意更改稀釋倍數(shù)，同時(shí)稀釋用水應(yīng)符合要求；應(yīng)選擇加液精度高、分配均一性好、殘液量小的酶標(biāo)洗板機(jī)，按照試劑盒說明書的要求設(shè)置洗滌次數(shù)、浸泡時(shí)間；應(yīng)根據(jù)酶標(biāo)板的規(guī)格對(duì)吸液頭高度進(jìn)行調(diào)整。洗板時(shí)要注意洗液不要溢出孔外，隨時(shí)觀察洗板情況以及時(shí)發(fā)現(xiàn)洗板針堵塞而引起的洗板故障。不要人為增加或減少洗板次數(shù)及浸泡時(shí)間，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性、白板、重復(fù)性差等問題[9]。

3.4.4 讀板

讀板是ELISA操作的最后一步，顯色反應(yīng)終止后立即使用酶標(biāo)儀比色，終止后一段時(shí)間后再比色對(duì)最后結(jié)果會(huì)有較大影響。測(cè)定前先用棉簽把酶標(biāo)板底部的水珠擦干凈，檢查各孔是否有氣泡，否則測(cè)定值會(huì)變高，有可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。酶標(biāo)板轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀的過程中一定要?jiǎng)幼鬏p柔，避免酶標(biāo)孔中液體濺出。應(yīng)嚴(yán)格說明書要求設(shè)定比色波長(zhǎng)、陰陽性對(duì)照、計(jì)算公式等參數(shù)。任何參數(shù)設(shè)置的錯(cuò)誤都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的錯(cuò)誤，需要格外注意。

3.5 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素尤其是環(huán)境溫度對(duì)ELISA試驗(yàn)多個(gè)過程都有影響，最主要的是對(duì)加液量有較大影響。因此根據(jù)試驗(yàn)要求選擇合適的實(shí)驗(yàn)室溫度并保持恒定可減少由于實(shí)驗(yàn)室溫度帶來的多種不確定性。

4 結(jié)論

綜上所訴，利用不確定度來源分析的理念，確定影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的因素及對(duì)每個(gè)影響環(huán)節(jié)進(jìn)行規(guī)范控制，將對(duì)保證ELISA檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可信具有重要意義。