賀強(qiáng)

（湖北省咸寧市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心 湖北咸寧 437000）

1 前言

微生物種類繁多，廣義上來(lái)講，細(xì)菌就是微生物的一種，我們的日常生活離不開(kāi)微生物。有些有益菌可以被人類利用，如利用酵母發(fā)酵釀酒，利用放線菌提取抗生素等等；有些致病菌則威脅人類健康，如葡萄球菌可引起化膿性疾病[1]，鏈球菌可引起腦膜炎等[2]。食源性致病菌主要包括大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli），溶血性鏈球菌（Hemolytic Streptococcus），福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，S.flexneri）及沙門氏菌（Salmonella）等。

2 食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)致病菌檢測(cè)技術(shù)主要是以形態(tài)學(xué)特征、生化反應(yīng)特征以及顯微鏡檢測(cè)為主，一般方法是將待測(cè)樣品直接染色鏡檢或通過(guò)分離培養(yǎng)獲得單菌落后，再進(jìn)行生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等對(duì)菌種進(jìn)行鑒定[3]。這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)操作者的技術(shù)要求很高，需要不斷進(jìn)行分離培養(yǎng)，一般需要5～7 d，不能滿足實(shí)際監(jiān)督執(zhí)法的時(shí)間需求。

2.2 儀器檢測(cè)技術(shù)

由于致病菌的結(jié)構(gòu)成分、代謝產(chǎn)物不同及微量生化反應(yīng)不同，因此可以利用基質(zhì)輔助激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、全自動(dòng)微生物鑒定儀等[4-5]對(duì)致病菌進(jìn)行分類鑒定。其中蛋白質(zhì)是鑒定致病菌種類的最主要指標(biāo)之一，通過(guò)儀器分析致病菌的蛋白組分，獲得不同的特征峰圖譜，再與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的特異性檢測(cè)。有研究者運(yùn)用MALDITOF-MS方法與16SrDNA測(cè)序法對(duì)1019株菌株進(jìn)行了鑒定實(shí)驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的準(zhǔn)確性高達(dá)95%[6]。崔昌浩等人則通過(guò)GC-MS分析了微生物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸，建立了分析方法[7]。這些方法靈敏度高、高通量、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快，可鑒定多種成分，但儀器設(shè)備成本昂貴，無(wú)法普及使用。

2.3 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，再利用同位素標(biāo)記、酶聯(lián)反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)。常用的免疫技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（IFT）、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)（ICGT）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、免疫層析技術(shù)（ICA）等。

2.3.1酶聯(lián)免疫吸附

簡(jiǎn)稱ELISA法，主要是將抗原-抗體的免疫反應(yīng)與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)。基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，然后與待測(cè)樣品的抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物所帶的酶再與酶的底物進(jìn)行催化反應(yīng)形成有色產(chǎn)物。1977年，研究者首次運(yùn)用ELISA檢測(cè)食品中的沙門氏菌[8]，Hochel等研究人員又運(yùn)用ELISA檢測(cè)空腸彎曲菌[9]，檢出限為50 cfu/mL。由于酶的催化效率很高，可以將反應(yīng)效果放大，從而使該檢測(cè)方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。具有操作簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)需任何昂貴儀器即可快速獲得讀數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，更適合現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。

2.3.2免疫熒光標(biāo)記

免疫熒光標(biāo)記是運(yùn)用免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)確定特異性蛋白抗原的結(jié)合部位，進(jìn)而檢測(cè)出致病菌。此方法不僅檢驗(yàn)速度快，而且敏感度與特異度均較高，現(xiàn)已成功應(yīng)用于細(xì)菌、真菌以及病毒等微生物的快速檢驗(yàn)中，并取得了滿意效果[10-11]。但由于標(biāo)記過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)非特異性染色而造成假陽(yáng)性結(jié)果，主觀性判斷易使結(jié)果存在一定偏差。

2.3.3免疫膠體金標(biāo)記

免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，簡(jiǎn)稱ICGT，也是運(yùn)用抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)原理，但是以膠體金作為標(biāo)記物，是近些年研發(fā)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[12]。Faulk等運(yùn)用免疫膠體金標(biāo)記法來(lái)研究沙門氏菌，這也是此技術(shù)首次在致病菌檢測(cè)的應(yīng)用[13]。有研究人員研發(fā)出一種可同時(shí)檢測(cè)志賀氏菌和大腸桿菌O157：H7的免疫膠體金標(biāo)記層析試紙條。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)具有成本低、簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可操作、無(wú)需復(fù)雜的大型儀器設(shè)備、簡(jiǎn)單且快速適用現(xiàn)場(chǎng)和基層檢測(cè)使用（反應(yīng)不超過(guò)15 min，具有靈敏度高）等特點(diǎn)。但是實(shí)際生產(chǎn)的膠體金由于批間差異大，抗原或抗體易從金顆粒表面脫離，使得標(biāo)記物不穩(wěn)定，并且只能獲得定性或者半定量結(jié)果。

2.3.4化學(xué)發(fā)光免疫分析法

CLIA是將特異性免疫反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出被測(cè)物的含量。有研究者運(yùn)用多重夾心化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)法，同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7和腸炎耶爾森菌[14]。但在實(shí)際操作中，化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度與所處的實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素有關(guān)，對(duì)發(fā)光強(qiáng)度-時(shí)間的曲線影響較大。

2.3.5免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)主要是將待測(cè)物與抗原或抗體標(biāo)記形成的復(fù)合物與被富集或固定在層析條上的特定區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合，再通過(guò)免疫技術(shù)顯色，實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測(cè)。具有簡(jiǎn)便、快速、無(wú)需任何儀器設(shè)備等優(yōu)勢(shì)。Serebrennikova K.等研究發(fā)現(xiàn)，采用分級(jí)納米金標(biāo)記可提高側(cè)流免疫層析的靈敏性，這種方法不需要增加新的制備步驟或消耗特殊的試劑（如抗體等），為提高基于納米金側(cè)流免疫分析的靈敏性提供了新的思路[15]。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是基于抗原一抗體的特異性免疫反應(yīng)而發(fā)展的，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的局限性，如抗體制備周期長(zhǎng)、成本高、穩(wěn)定性較差等，免疫反應(yīng)過(guò)程易受目標(biāo)物及競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性。

2.4 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是通過(guò)檢測(cè)致病菌中的特征性核酸序列實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的鑒定，是一種體外核酸特異性擴(kuò)增技術(shù)。主要方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）、多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、基因芯片、DNA測(cè)序等。

2.4.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR，是檢測(cè)食源性致病菌最常用的分子生物學(xué)手段之一，可在體外快速擴(kuò)增核酸序列，主要用于檢測(cè)食品中單一的致病菌，如單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、金黃色葡萄球菌等[16]。該方法通過(guò)檢測(cè)待測(cè)菌株是否含有毒力基因來(lái)鑒別區(qū)分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株，但對(duì)操作者的專業(yè)技能要求較高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[17]。

2.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)稱RT-PCR，是在PCR反應(yīng)過(guò)程中加入特異性熒光探針，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定量分析。Alejandro等建立了RT-PCR檢測(cè)副溶血性弧菌tdh基因的方法，檢出限為6 cfu/25g[18]。相比于普通的PCR，RT-PCR省去了電泳染色驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果，減少了外源核酸對(duì)結(jié)果的干擾，并且能持續(xù)檢測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程，實(shí)用性較高。

2.4.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)稱LAMP，是一種新型核酸擴(kuò)增方法，由日本學(xué)者Notom于2000年首次提出。該方法主要是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)4種特異引物，在酶的作用下實(shí)現(xiàn)60℃～65℃恒溫?cái)U(kuò)增。Maruyama等首先將LAMP用于檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的stxA2基因[19]，鑒于LAMP的快速性和敏感性等特征，此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種食源性致病菌檢測(cè)中。與傳統(tǒng)的PCR及RT-PCR相比，LAMP反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊儀器，使用簡(jiǎn)便、快捷，適合快速檢測(cè)。

2.4.4基因芯片

基因芯片是將大量的探針?lè)肿庸潭ㄔ谛酒d體表面，然后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度來(lái)獲取樣品分子數(shù)量級(jí)序列信息，是一種高通量、自動(dòng)化、微型化的新型核酸測(cè)定方法。陳昱等利用基因芯片技術(shù)建立了檢測(cè)3種食源性致病菌的方法，檢出限為50 CFU/mL，該方法特異性好、靈敏度高[20]?；蛐酒梢淮涡詫?duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測(cè)效率低等不足，是目前常用的致病菌檢測(cè)方法之一。

分子生物學(xué)技術(shù)近年來(lái)在食源性致病菌檢測(cè)方面發(fā)展較為迅速，主要優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在檢測(cè)過(guò)程的快速性、高靈敏度、高特異性等方面。在實(shí)際應(yīng)用中，也存在一定的局限性，如檢測(cè)前的核酸提取、樣品的增菌處理增加了檢測(cè)的步驟，實(shí)驗(yàn)環(huán)境帶入假陽(yáng)性問(wèn)題等，但隨著研究的不斷深入，這些限制性因素會(huì)被逐漸優(yōu)化。

2.5 光譜分析技術(shù)光譜學(xué)主要研究

各種物質(zhì)的光譜的產(chǎn)生及其同物質(zhì)之間的相互作用，攜帶著一定的分子信息，可用于檢測(cè)識(shí)別生物物質(zhì)。光譜分析技術(shù)可克服實(shí)驗(yàn)環(huán)境的局限，不受外部環(huán)境干擾，減少致病菌培養(yǎng)環(huán)節(jié)，提高檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[21-22]。光譜分析技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用主要包括紅外光譜技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、熒光光譜技術(shù)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、表面等離子共振光散射技術(shù)等。

2.5.1紅外光譜技術(shù)

紅外光譜技術(shù)一般用于研究物質(zhì)分子，是一種振動(dòng)光譜[23]。根據(jù)光譜的峰位、峰形等可鑒別不同的菌體。Wang等通過(guò)采集6種食源性致病菌的光譜，在3個(gè)不同的波段對(duì)致病菌成功進(jìn)行鑒別[24]。這種方法只需少許的細(xì)菌懸浮液就能對(duì)致病菌進(jìn)行種和亞種的區(qū)分，具有簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果可靠的優(yōu)勢(shì)。

2.5.2近紅外光譜技術(shù)

近紅外（NIR）技術(shù)主要通過(guò)含氫基團(tuán)H-X伸縮振動(dòng)的倍頻和合頻吸收紅外光，從而獲得待測(cè)樣品的信息。微生物主要由核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)構(gòu)成，不同物質(zhì)對(duì)近紅外光的吸收不同，形成不同特性的光譜[25]。2003年，Janie Dubois等人利用微生物在1 000～2 350 nm波段的近紅外光吸收特性，對(duì)微生物進(jìn)行了分類學(xué)鑒定[26]。劉建學(xué)等利用立葉變換近紅外光譜技術(shù)（FT-NIR）建立了大腸埃希氏菌O157：H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法[27]。近紅外技術(shù)具有快速、方便、能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)多組分無(wú)損檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適用性強(qiáng)、具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷成熟，近紅外技術(shù)將成為一種更加高效的現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)。

2.5.3表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)簡(jiǎn)稱SERS，由Fleischmann于1974年首次提出[28]，和紅外光譜一樣同屬分子振動(dòng)光譜，能反映分子的特征結(jié)構(gòu)。但是拉曼的信號(hào)比較微弱，需要將待測(cè)樣品吸附在粗糙的金屬表面，信號(hào)將會(huì)大幅增強(qiáng)，這就是表面增強(qiáng)拉曼散射現(xiàn)象。Gao等利用SERS建立了金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，檢出限為1.5 CFU/mL[29]；Pearson等利用基于3-巰基苯磺酸（3-mbpa）作為納米基底建立了具有選擇性的單增李斯特菌檢測(cè)方法，檢出限為102CFU/mL[30]。SERS具有無(wú)標(biāo)記識(shí)別、操作簡(jiǎn)單、可實(shí)現(xiàn)快速分析等優(yōu)勢(shì)，在快速檢測(cè)食源性致病菌方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.5.4熒光光譜技術(shù)

物質(zhì)經(jīng)過(guò)短波長(zhǎng)的光照射后，輻射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光，這種光就是熒光。熒光光譜技術(shù)是一種重要的光電檢測(cè)技術(shù)。有研究表明，微生物體內(nèi)的某些氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸）以及核黃素等可作為熒光物質(zhì)[31]。Leblanc等采用熒光光譜技術(shù)對(duì)25種菌株進(jìn)行了種、屬水平的分類鑒定[32]；Sohn等利用熒光光譜技術(shù)建立了食品中大腸桿菌、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬方法[33]。熒光光譜技術(shù)具有靈敏度高、信號(hào)重現(xiàn)性好、測(cè)量精度高等優(yōu)勢(shì)，多用于定量分析，將逐漸成為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一種重要手段。

2.5.5表面等離子共振光散射技術(shù)

表面等離子共振光散射技術(shù)簡(jiǎn)稱SPR，是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，光學(xué)信號(hào)在傳感器的作用下轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)。1998年，F(xiàn)ratamico利用SPR傳感器首次檢測(cè)了大腸桿菌O157：H7[34]；Nguyen等采用SPR建立了沙門氏菌的檢測(cè)方法，1 h內(nèi)的檢出限為107～109cfu/mL[35]。雖然在檢測(cè)致病菌方面，表面等離子共振光散射技術(shù)靈敏度不夠高，但作為一種便攜型儀器設(shè)備在未來(lái)應(yīng)用前景不可估量。

近些年，光譜技術(shù)的逐漸成熟，光其表現(xiàn)的無(wú)損檢測(cè)、非侵入特點(diǎn)以及在食源性致病菌檢測(cè)方面表現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)，使得光譜技術(shù)在某些致病菌檢測(cè)方面可以有效替代傳統(tǒng)檢測(cè)方法。

3 結(jié)論

綜上所述，隨著現(xiàn)代科學(xué)儀器的發(fā)展，更多的檢測(cè)技術(shù)被發(fā)掘，從分子手段檢測(cè)到生化儀器分析檢測(cè)，更多新型的檢測(cè)方法已應(yīng)用于各種食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中，這為食品安全加固了一道強(qiáng)有力的安全防線，同時(shí)也給食品檢驗(yàn)檢測(cè)工作帶來(lái)了更多的技術(shù)性挑戰(zhàn)。