楊佳萍，寇美玲，，謝佳芮，苗海生

（1.施甸縣畜牧獸醫(yī)中心，云南施甸 678200；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬和野豬引起的一種急性、熱性和高度致死性傳染病。該病發(fā)病快、病程短，病死率可高達100%，為世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報動物疫病，也是我國重點防范的一類動物疫病。2018 年8 月首次發(fā)現(xiàn)ASF 疫情后，我國采取了撲殺疫區(qū)內生豬等一系列緊急防控措施，截至2021年5 月底，全國報告發(fā)生ASF 疫情共191 起，累計撲殺生豬121.01 萬頭，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[1-3]。由于ASFV 具有龐大的基因組結構和復雜的免疫逃逸機制，使得疫苗開發(fā)極具挑戰(zhàn)性，至今仍無安全有效疫苗上市[4]。在豬群沒有進行有效疫苗接種的前提下，ASFV 抗體產(chǎn)生存在一定的滯后性，抗體檢測易出現(xiàn)假陽性且無法判定現(xiàn)癥感染[5]。因此，建立快速、可靠的病原學診斷方法對于該病早期的防控和撲滅具有重要意義。本文綜述了當前國內外ASF 疫苗和病原學診斷技術的研究進展，以期為今后ASF 疫苗研制和診斷技術選擇提供參考。

1 疫苗研究

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗是通過物理或化學過程使病原微生物喪失感染性與毒性，但仍保留免疫原性的一類疫苗。ASF 剛被發(fā)現(xiàn)時，研究人員就以滅活疫苗為主要研制方向，但迄今為止，所研制的各種滅活疫苗均不能抵御ASF 強毒株的攻擊，不能提供有效保護[6]。Blome 等[7]利用新型佐劑PolygenTM或Emulsigen?-D 研制出的滅活疫苗，雖然能誘導機體產(chǎn)生針對性的特異抗體，但所有實驗動物均無法抵御ASFV 攻擊，不能提供有效的免疫保護作用。因此，該類疫苗當前已不作為研究的重點方向。

1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過分離鑒定天然致弱毒株或使用人工手段產(chǎn)生致弱毒株，經(jīng)特殊培養(yǎng)后所制備的活疫苗。與滅活疫苗相比，減毒活疫苗能夠誘導強烈持久的免疫應答，同源保護率高，但毒力有自然返強的可能，存在諸多生物安全隱患。根據(jù)毒株來源不同，可將ASFV 弱毒活疫苗的研制分為傳統(tǒng)減毒活疫苗和重組減毒活疫苗兩類。

1.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗 20 世紀60 年代，西班牙和葡萄牙暴發(fā)ASF 疫情后，有研究者進行了田間試驗，發(fā)現(xiàn)弱毒活疫苗能為豬只提供同源保護及部分異源保護，但接種豬出現(xiàn)了肺炎、流產(chǎn)等多重感染，且增加了ASFV 再次感染的風險[8-9]。后有學者利用天然分離的致弱毒株（OURT88/3 或NH/P68）制備減毒活疫苗。這類疫苗能對同源ASFV產(chǎn)生有效的免疫保護，但對異源ASFV 保護率低甚至沒有保護，且存在毒力自然返強、臨床副作用嚴重等問題[10-11]。近年來，隨著新分子生物學技術的進步，尤其是基因編輯技術的突破性進展，這種基于自然毒株弱化的方式已逐漸被淘汰。

1.2.2 重組減毒活疫苗 科研人員利用基因編輯、同源重組等分子生物學技術將ASFV 毒力基因敲除，以降低ASFV 毒力，致力于研制安全有效的重組致弱活毒株疫苗。Borca 等[12]發(fā)現(xiàn)：從Georgia07 分離株（ASFV-G）中刪除一個先前未經(jīng)鑒定的基因I177L會導致其毒力完全衰減。肌肉注射缺失I177L基因ASFV-G-ΔI177L毒株的動物，在28 d 的觀察期內臨床癥狀正常，且病毒血癥滴度低，沒有病毒脫落，并出現(xiàn)強烈的特異性抗體反應；重要的是，當與強毒力親本菌株ASFV-G 競爭時，即使在低劑量免疫的情況下，它們也能提供保護，在安全候選疫苗中極具潛力，為ASFV 減毒活疫苗的研制提供了新的技術和研究思路。Chen等[13]以我國第一株ASFV 分離株HLJ/2018 為骨架，利用同源重組技術構建了一系列不同基因缺失的重組病毒，通過在豬體內進行系統(tǒng)的致病力、免疫原性和免疫保護性試驗，遴選出一株7 個基因缺失的病毒（HLJ/18-7GD）；通過對其安全性、有效性進行試驗研究發(fā)現(xiàn)，該毒株可對強毒的致死性攻擊提供有效免疫保護，不產(chǎn)生病毒血癥，且不存在毒力返強風險；該毒株對育肥豬生長發(fā)育和接種母豬繁殖性能無不良影響，對田間商品豬存活保護率在80%以上，是當前所研發(fā)的疫苗中保護性和安全性兼具的疫苗，具有良好的應用前景。但鑒于能繁母豬生產(chǎn)利用周期長，該疫苗接種后的安全性、有效性等有待進一步觀測、評估。

1.3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是基于選擇合適的ASFV 抗原基因進行開發(fā)的，與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗相比，基因工程疫苗成本低且安全性高，可以誘導產(chǎn)生ASFV 特異性抗體及相應的細胞免疫反應，但面對強毒株攻擊的有效保護作用不強。目前基因工程疫苗研究主要集中在p72、p30、p54、CD2v等抗原基因及其編碼蛋白，包括亞單位疫苗、DNA 疫苗、病毒活載體疫苗。

1.3.1 亞單位疫苗 亞單位疫苗是利用特異性ASFV 基因和蛋白的表達來產(chǎn)生特異性免疫應答的一類疫苗。其研究策略主要是將具有中和表位的ASFV 保護性抗原基因在原核或真核細胞中表達，然后將產(chǎn)生的蛋白質或多肽遞呈給抗原遞呈細胞，以誘導產(chǎn)生高滴度的抗ASFV 中和抗體。與其他疫苗相比，亞單位疫苗較安全，但保護性不強，目前已研發(fā)的亞單位疫苗還無法抵御強毒株的攻擊[14-15]。研究表明，針對p72和p54基因所表達的蛋白對病毒吸附具有抑制作用，而針對p30所表達的蛋白則對病毒內化具有抑制效果，說明這些功能性蛋白在針對感染所產(chǎn)生的體液免疫應答中起著關鍵作用，但經(jīng)p30或p54基因疫苗免疫的豬在面對急性ASF時均沒有保護作用[16]。Netherton 等[17]利用腺病毒和痘苗病毒作為載體，表達18 種能被ASFV 特異性淋巴細胞識別的抗原，結果發(fā)現(xiàn)未能提供有效保護，但接種豬血液中的病毒滴度明顯低于未免疫豬。Jancovich 等[18]通過干擾素-γ 酶聯(lián)免疫吸附點試驗測定了豬免疫淋巴細胞對單個重組蛋白和ASFV的反應。利用DNA 抗原病毒將47 種ASFV 蛋白的重組痘苗病毒疫苗免疫豬后篩選ASFV 的保護性抗原，結果篩選出p30 和p72 蛋白能有效刺激機體體液免疫及細胞免疫應答；雖然免疫豬出現(xiàn)了與急性ASF 一致的臨床和病理體征，但與未免疫豬相比，其血液和一些淋巴組織中的病毒基因組水平顯著降低。因此，研究和開發(fā)更多的ASFV 保護性抗原或新型免疫佐劑，刺激機體產(chǎn)生免疫應答效力是當前研制ASFV 亞單位疫苗的關鍵。

1.3.2 DNA 疫苗 DNA 疫苗是通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達載體后，直接導入機體內，在宿主細胞內完成轉錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白，從而激活宿主特異性的體液免疫和細胞免疫。DNA 疫苗制備簡單、成本低廉，可同時表達多種抗原且無毒力逆轉危險，但其中和病毒能力不強，面對ASFV 強毒株的攻擊不能提供有效保護[19]。Argilaguet 等[20]將CD8+T 細胞作為ASFV 保護的關鍵元件，設計了一個新的質粒結構pCMV-UbsHAPQ，編碼3 種病毒決定因子（sHA、p54 和p30）與泛素融合，旨在改善Ⅰ類抗原，并增強誘導CTL 的效應。結果顯示，在不存在抗體的情況下，該質粒結構能成功誘導免疫豬特異性的T 細胞反應，且可保護一部分免疫豬免受ASFV 的致命挑戰(zhàn)。Sunwoo 等[21]用ASFV 質粒DNA（CD2v，p72，p32，+/?p17）和重組蛋白（p15，p35，p54，+/?p17）混合后對豬進行3 次接種，以測試聯(lián)合DNA-蛋白疫苗是否能抵抗ASFV Armenia 2007 株的攻擊，結果發(fā)現(xiàn)免疫豬雖然產(chǎn)生了特異性抗體，但缺乏中和病毒的能力，而且被觀察到在體外ASFV 感染力增強。因此，DNA 疫苗要達到有效免疫保護的目標仍需要進一步深入研究。

1.3.3 病毒活載體疫苗 病毒活載體疫苗是利用基因工程技術，將致病微生物免疫保護性抗原的基因，導入到載體病毒或細菌的非必須區(qū)而構建重組病毒，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗。該類疫苗在對抗人類易感病毒或動物易感病毒中均得到了廣泛應用，并取得了良好的應用效果。Lokhandwala等[22-23]評估了多種腺病毒載體新型ASFV 抗原的免疫原性，將重組腺病毒配制在佐劑中混合免疫商品豬，發(fā)現(xiàn)免疫豬大多數(shù)能夠誘導安全強特異性抗體和IFN-γ 細胞分泌。但是，這些研究還未涉及免疫保護試驗和安全性評估，其保護效力和安全性仍有待進一步驗證。Murgia 等[24]利用α 病毒載體平臺傳遞表達ASFV 抗原的復制粒子（RPs）抗原，分別構建了表達ASFVp30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）的抗原載體，并且測試了3 種載體抗原在Vero 細胞中的表達和在豬身上的免疫原性。結果顯示，RP-30 在Vero 細胞中表達最高，在豬中免疫原性最高，其次是RP-54和RP-sHA-p72。該研究通過用ASFV 天然減毒株OURT88/3 增強免疫RP-30 接種豬，證實了將減毒活病毒增強策略和載體表達抗原構建相結合可擴大對ASFV 表位的識別。Lokhandwala 等[25]再次使用BioMize 和ZTS-01 兩種佐劑對豬進行鼻內刺激免疫，通過該方法來評估兩種不同“雞尾酒”佐劑的保護效果。結果顯示：BioMize 佐劑可誘導豬產(chǎn)生強烈的抗體反應，但80%疫苗接種豬死于強毒株Georgia2007 的攻擊；相比之下，ZTS-01 佐劑誘導產(chǎn)生的抗體反應較弱，但約56%豬能夠抵抗強毒株Georgia2007 的攻擊，在攻毒后17 d 內表現(xiàn)的臨床癥狀輕微，且無病毒血癥。ASFV 活載體疫苗的研究還在持續(xù)進行中，載體毒株的選擇，保護性抗原的選擇和設定以及佐劑的優(yōu)化是該類疫苗的重點研究方向。

2 病原學診斷技術

目前沒有商品化的疫苗可用于ASF疫情防控，因此建立快速、可靠的病原診斷方法，對于該病早期預警和科學防控具有重要意義。病原學診斷技術是針對病原體本身采取的檢測方法，能夠在ASF暴發(fā)早期檢測出動物體內是否帶毒。相較于血清學檢測，病原學檢測能更快速、可靠地確定病原體。檢測人員也可根據(jù)臨床發(fā)病情況和實驗室診斷條件選擇合適的檢測方法。例如，快速鑒別診斷、核酸定量可采用實時熒光定量PCR（qPCR）和微滴數(shù)字PCR（ddPCR）類核酸檢測技術，基層現(xiàn)場快速檢測可使用環(huán)介導恒溫擴增技術（LAMP）、重組酶聚合酶擴增技術（RPA）類等溫擴增檢測技術，或成簇規(guī)律間隔短回文重復序列相關蛋白技術（CRISPR/Cas）等。具體適用場景可根據(jù)自身的人員情況、儀器設備和試驗條件選擇合適的檢測方法。

2.1 qPCR

qPCR 方法是將光譜技術引入到PCR 反應中，通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產(chǎn)物的量，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的一種核酸定量檢測技術。該技術與常規(guī)PCR 相比，去掉了瓊脂糖凝膠電泳，速度更快，具有特異靈敏、定量準確、操作簡便以及樣品污染小和自動化程度高等優(yōu)點[26]。OIE 及國家ASF 參考實驗室均公布了標準檢測方法，為ASF 診斷提供了技術支撐。此外，崔貝貝等[27]以ASFVK196R基因為靶標，建立了快速檢測 ASFV 的TaqMan qPCR 檢測方法，證實該方法特異性強、靈敏度高，對檢測樣品和環(huán)境要求相對較低，且與其他多種豬病病原不存在交叉反應，適合大批量樣品檢測。吳亞楠等[28]參照GenBank 登錄的ASFVP72相關基因序列，設計合成1 對特異性引物與1個TaqMan 探針，通過反應條件和反應體系優(yōu)化，建立了快速檢測ASFV 的TaqMan qPCR 方法。驗證結果顯示，該試驗所建立的方法具有很好的靈敏性、特異性和重復性。目前qPCR 方法是篩查和確診ASFV 感染的主要方法，許多縣市級動物疫病預防控制中心和屠宰場均配備了相應的儀器設備，具備了檢測ASFV的能力。但是，qPCR 產(chǎn)物易污染環(huán)境和試劑，需要嚴格劃分樣品處理、試劑配制和擴增區(qū)域，一旦操作不當就會出現(xiàn)假陽性，必要時還需進行普通PCR 驗證和序列測定。

2.2 ddPCR

ddPCR 結合了液滴微流控芯片與數(shù)字PCR 技術，是一種新的絕對定量技術。該技術不僅繼承了數(shù)字PCR 技術高通量、高靈敏度、低消耗等優(yōu)點，而且解決了傳統(tǒng)數(shù)字PCR 芯片結構復雜、加工困難、成本高等問題。它不依賴于標準曲線，在低濃度的核酸含量下也可高度靈敏和準確地對核酸拷貝數(shù)進行絕對定量，在核酸分子的絕對定量領域具有極大潛力[29-30]。原霖等[31]建立的ddPCR 方法，最低檢測限可達0.8 copies/μL，檢測結果與qPCR 相符，且敏感性高于qPCR，因此更加適用于ASFV的早期檢測以及泔水、飼料、豬肉產(chǎn)品中微量核酸的檢測，對于防控和開展流行病學溯源工作都具有重要意義。嚴禮等[32]根據(jù)ASFV 核酸的2 段保守序列（VP72和K205基因），合成3 對引物和探針，在摸索條件、優(yōu)化方法后，比較方法的線性、特異性、靈敏性和重復性。結果表明，這3 種方法重復性好、特異性強，能滿足快速定量檢測的要求，且不與常見的2 種豬病毒發(fā)生交叉反應，適用于豬肉及其制品中的ASFV 檢測，有利于在源頭、食品加工、食品銷售等各個環(huán)節(jié)，加強對生鮮豬肉及各類豬肉制品的檢測，切實降低潛在風險。由于該檢測方法所需要儀器設備價格高昂，目前主要在高級別實驗室使用，尚未能在基層實驗室推廣應用。

2.3 LAMP

LAMP 是日本Notomi[33]發(fā)明的一種基于鏈置換DNA 聚合酶的恒溫核酸擴增方法。該方法不需要PCR 中的熱變性、溫度循環(huán)、電泳成像等過程，只需簡單的恒溫設備即可完成基因擴增和產(chǎn)物檢測，且整個擴增反應時間一般少于60 min。田純見等[34]利用高度保守的非結構DNA 聚合酶G1211R基因，制備質粒標準品，建立了實時熒光LAMP方法，檢測ASFV 核酸靈敏度達到10-5以上，相當于每個反應體系可以檢出21 pg 病毒DNA，優(yōu)于qPCR 檢測結果（10-3），且重復性和特異性良好，與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及昆蟲核酸等無交叉反應，有利于不同基因型毒株檢測和出入境快速篩查。王林等[35]根據(jù) ASFVP72基因保守區(qū)域設計特異性引物，優(yōu)化引物濃度、反應溫度、反應時間，建立了一種基于SYTO9 熒光染料的實時熒光LAMP 快速檢測方法。該方法可在40 min內完成檢測反應。LAMP 技術與常規(guī)PCR 方法相比具有敏感性高，操作簡單、快速，對儀器設備要求低，可實現(xiàn)現(xiàn)場、可視化檢測等優(yōu)點，但常因操作不當造成產(chǎn)物污染試劑，再次檢測時易出現(xiàn)假陽性，并且單份樣品檢測成本較高，因而目前尚未大面積推廣。

2.4 RPA

RPA 是一種由重組酶、單鏈DNA 結合蛋白和鏈置換Bsu 聚合酶參與的恒溫擴增新技術。該技術在體外進行核酸擴增時不需要加熱，在23～45 ℃下即可完成對雙鏈DNA 的解鏈處理并進行循環(huán)擴增，不需要昂貴的控溫設備，反應時間只需5～20 min，特異性強、靈敏度高，與qPCR 相比更簡單、經(jīng)濟、快速，適用于實驗室外及資源匱乏地區(qū)的現(xiàn)場檢測[36]。張皓淳等[37]選擇pcDNA12L 和pcDNA13L作為標準質粒，建立了RPA 等溫檢測方法，檢測結果體現(xiàn)出RPA 具有較好的特異性和敏感性，與PCR 檢測方法相比檢測下限提高程度明顯，具有一定運用優(yōu)勢。吳映彤等[38]基于MGF360-12L基因序列，設計并合成引物，建立了RPA 等溫檢測方法。結果顯示：該方法35 ℃恒溫反應30 min 即可實現(xiàn)對目的片段的穩(wěn)定擴增；檢測限可達到103個拷貝，同普通PCR 方法檢測限一致，但反應時間僅為普通PCR 的1/4；與其他豬病毒無交叉反應，特異性較強；操作簡單、反應快速、檢測成本低，可滿足疫病快速現(xiàn)場檢測的需求。目前該檢測方法在推廣中面臨的瓶頸問題主要是需要進行專門的核酸提取，導致反應快速的突出優(yōu)勢并未完全展示，另外還存在檢測成本較高和穩(wěn)定性差的問題。

2.5 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas 核酸檢測技術是近年來發(fā)展起來的一項新的檢測技術，一經(jīng)問世便得到了廣泛關注。該技術由CRISPR RNA（cr RNA）和Cas 蛋白組成，是原核生物的“免疫系統(tǒng)”，其中crRNA 與靶序列互補，可引導Cas 蛋白進行序列特異性識別和切割，對入侵的核酸分子進行切割使其降解，從而釋放出信號達到檢測效果。CRISPR/Cas 核酸檢測技術可提供快速、靈敏、現(xiàn)場、特異的定量分析與多重分析，不需要繁瑣的操作處理及昂貴的輔助儀器，僅通過熒光、電化學及可視化等方法進行信號讀取，就可實現(xiàn)病原微生物的精準檢測、監(jiān)測與控制，是目前ASFV 檢測的熱門方向[39]。Wang 等[40]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a 技術和橫向流檢測（CRISPR/Cas12a-LFD）的快速、敏感、無儀器的ASFV 檢測方法。該方法所檢測樣本結果與qPCR檢測一致，但檢測時間比qPCR 更短，且與其他豬DNA 病毒無交叉反應，比較適用于現(xiàn)場診斷。He等[41]將CRISPR-Cas 檢測技術與基于熒光的護理點（POC）系統(tǒng)結合起來，建立了一個高通量、全液相的等溫檢測系統(tǒng)。該方法易操作、特異性強、敏感度高，且不需要專家指導。目前該技術仍然處于實驗室研發(fā)階段，未見有商品化的產(chǎn)品推出。

3 展望

面對ASF 疫情，我國雖然采取了封鎖隔離、撲殺疫點內生豬等一系列緊急防控措施，但疫情仍時有發(fā)生，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。要阻斷疫病的傳播，除了做好生物安全防控措施外，疫苗和準確的早期診斷是亟需的防控手段。近年來，ASF 疫苗的研究雖取得了較大進展，但由于ASFV具有龐大的基因組結構和復雜的免疫逃逸機制，使得當前所研發(fā)的疫苗株接種豬后普遍存在免疫保護效果不佳、毒力返強、副反應嚴重等問題?；谝陨蠈σ呙缪芯楷F(xiàn)狀的分析，在眾多的疫苗研發(fā)策略中，目前只有利用天然分離或敲除ASFV 毒力基因的致弱毒株開發(fā)重組減毒活疫苗具有較好的利用前景，尤其是ASFV-G-ΔI177L與HLJ/-18-7GD 候選疫苗株，被認為是短期內保護效果最理想的疫苗株，但安全性和有效性仍有待進一步研究。隨著對ASFV 基因組結構、免疫逃逸機制的深入研究和CRISPR/Cas9 等新型分子生物學技術的興起，相信安全、高效、特異性強的ASF 疫苗面世將指日可待。

目前在沒有有效疫苗免疫的前提下，建立快速、可靠的早期病原診斷方法對于ASF 疫情確認和控制同樣至關重要。近年來，ASFV 檢測技術發(fā)展迅速，ddPCR、LAMP、RPA、CRISPR/Cas 等新興診斷技術相繼建立，與傳統(tǒng)檢測方法相比，這些新的檢測技術操作更簡單，檢測速度更快，特異性更強，但其檢測能力與適用場景尚存在一定不足，還需要進一步完善。隨著生物學研究的不斷發(fā)展，未來ASFV 檢測的研究方向應建立在成本低廉、簡單便捷、高效準確、集成化的基礎上，或可將多種診斷方法聯(lián)合應用，各取所長。