楊柏 趙偉鐸 張靜

（1.煙臺(tái)海關(guān)技術(shù)中心 山東煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)海關(guān)）

1 前言

PCR檢測(cè)技術(shù)能使微量DNA發(fā)生大幅增加，在動(dòng)物疫病檢測(cè)環(huán)節(jié)應(yīng)用該技術(shù)，能無(wú)限放大動(dòng)物DNA片段，為動(dòng)物疫病防治工作提供有利依據(jù)。但是運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物疫病時(shí)，一旦實(shí)驗(yàn)室受到污染，就會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。因此，有必要詳細(xì)梳理動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的污染源，針對(duì)性地采取有效對(duì)策加以防控，不斷改善實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，提高檢測(cè)質(zhì)量。

2 動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的污染原因

2.1 試劑污染

PCR試劑受到污染是造成PCR污染的關(guān)鍵原因之一，因?yàn)樵噭┰趯?shí)驗(yàn)操作中屬于基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)耗材，科學(xué)規(guī)范地存儲(chǔ)和使用試劑，能夠有效減少試劑在實(shí)驗(yàn)操作中所接觸的污染物。如果在配置PCR試劑過(guò)程中，出現(xiàn)操作不當(dāng)情況，就可能使加樣槍、雙蒸水、容器或其它相關(guān)溶液受到PCR核酸模板的污染。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物受污染

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物受污染也是造成PCR污染的一項(xiàng)常見(jiàn)的、重要的污染問(wèn)題。由于PCR產(chǎn)物具有極高的拷貝量，并且相應(yīng)量遠(yuǎn)高出PCR檢測(cè)的多個(gè)拷貝極限，即便受污染的PCR產(chǎn)物是極其微量的，都可能成為實(shí)驗(yàn)室的污染源，并在較大程度上破壞實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]。

2.3 樣本交叉污染

樣本間出現(xiàn)交叉污染也是引發(fā)PCR污染的關(guān)鍵因素，如果在儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)標(biāo)本過(guò)程中，不能做到密封嚴(yán)密或選用錯(cuò)誤的密封方法，就會(huì)造成樣本間發(fā)生交叉感染。另一種客觀原因是儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的容器受到污染，如樣本容器外部附著標(biāo)本引發(fā)交叉感染，或人為提取樣本核酸模板時(shí)操作不當(dāng)使移液槍受到污染等[2]。樣本交叉污染的情況在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中比較常見(jiàn)，必須規(guī)范操作，注意細(xì)節(jié)，避免樣本發(fā)生交叉污染問(wèn)題，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 操作人員的污染

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，操作人員盲目追求檢測(cè)效率，出現(xiàn)操作失誤的情況，或因操作人員防護(hù)不當(dāng)，其皮膚、頭發(fā)等所附著的細(xì)菌沾染試劑，也有可能會(huì)造成PCR污染。為避免這些問(wèn)題，操作人員需要高度重視實(shí)驗(yàn)規(guī)范化，注意操作細(xì)節(jié)要求及操作安全知識(shí)，充分做好防護(hù)措施，減少人員污染。

3 污染防控對(duì)策

3.1 預(yù)防污染措施

3.1.1 PCR實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)分區(qū)管理

為有效防止動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室受到污染，一個(gè)重要措施就是要在PCR實(shí)驗(yàn)室中加強(qiáng)分區(qū)管理，從根源上杜絕實(shí)驗(yàn)室污染，全面提升污染防治效果。在實(shí)際管理過(guò)程中，可把實(shí)驗(yàn)室劃分為3個(gè)區(qū)域：標(biāo)本處理區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)主要制備擴(kuò)增模板；PCR擴(kuò)增區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)主要進(jìn)行反應(yīng)液配置及PCR擴(kuò)增；產(chǎn)物分析區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)主要進(jìn)行凝膠電泳分析，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行拍照，同步制備重組克隆。在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中，需要采取有效措施將這些工作區(qū)完全分隔，并且在操作期間選用專(zhuān)業(yè)器械，盡可能防止發(fā)生交叉感染[3]。

3.1.2 保持良好的操作習(xí)慣

實(shí)驗(yàn)室中因操作不當(dāng)導(dǎo)致樣本交叉污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的事件時(shí)有發(fā)生，因此，實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)當(dāng)養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣。實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后都要通過(guò)紫外線消毒方式對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行消毒；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員需要按照要求使用一次性手套、帽子、口罩，根據(jù)不同分區(qū)使用專(zhuān)區(qū)專(zhuān)用的工作服，并注意勤換手套；在操作時(shí)要注意選擇一次性吸頭，相關(guān)吸頭要注意和PCR產(chǎn)物分析區(qū)所使用吸頭嚴(yán)格分開(kāi)，禁止混用，并且不能長(zhǎng)時(shí)間的將吸頭暴露在空氣當(dāng)中，以防氣溶膠受到污染；操作人員在打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)動(dòng)作要輕緩，以防發(fā)生反應(yīng)液飛濺情況，在開(kāi)蓋之前略微離心，保證液體全部收集在管底，一旦不小心濺到桌面或手套上，需立即更換手套，并使用稀酸對(duì)桌面進(jìn)行擦拭；在對(duì)多份樣本反應(yīng)液進(jìn)行制備時(shí)，要注意混合好dNTP、引物、緩沖液、酶，并做好分裝工作，減少重復(fù)操作，在規(guī)避污染的同時(shí)，還能提升檢測(cè)效率。

3.1.3 做好試劑分裝和儲(chǔ)存工作

在操作過(guò)程中，最好事先配置PCR反應(yīng)液，之后進(jìn)行小量分裝，在-20℃的環(huán)境中保存，減少重復(fù)加樣次數(shù)，進(jìn)而降低污染發(fā)生率。同時(shí)，要注意PCR試劑和反應(yīng)液，應(yīng)當(dāng)與PCR產(chǎn)物及樣品分開(kāi)保存，避免存放在同一冰箱內(nèi)或同一冰盒中。

3.1.4 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并降低PCR循環(huán)頻次

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要不斷優(yōu)化，盡量縮減PCR循環(huán)頻次，能夠保證PCR產(chǎn)物符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及水平即可，以有效規(guī)避大量高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物引發(fā)的污染問(wèn)題。若已經(jīng)發(fā)生了污染，需要立即通過(guò)正確方法追蹤污染物，明確污染源，做好污染處理工作，確保實(shí)驗(yàn)可以順利、有序的推進(jìn)。

3.2 污染源處理措施

3.2.1 通過(guò)酶法與化學(xué)法降解DNA

一旦動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)污染問(wèn)題，可通過(guò)2 mol/L的HCL或10%次氯酸鈉對(duì)污染源進(jìn)行浸泡及擦洗，使得所殘留的DNA分子受到破壞，將污染源全面消除。相對(duì)而言，10%次氯酸鈉對(duì)污染源的破壞力更強(qiáng)。如果雜質(zhì)DNA片段含有酶切位點(diǎn)，為有效消除污染源，可通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶加以處理，但是此方法在應(yīng)用中限制性?xún)?nèi)切酶需要使用高鹽溶液，對(duì)PCR反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一定影響。

3.2.2 運(yùn)用尿嘧啶DNA糖基化酶法

在PCR反應(yīng)中，將dTTP替換為dUTP，可使PCR產(chǎn)物中含有dU修飾，相應(yīng)DNA片段經(jīng)修飾后能夠被糖激化酶消化，去除其中的dU[4]。而DNA片段在失去dU之后，就無(wú)法被當(dāng)做PCR反應(yīng)模板。在實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)之前，把糖基化酶添加到未加Taq酶之前的PCR反應(yīng)混合液中，能夠消化之前殘留PCR產(chǎn)物中的dU，若模板DNA不包含dU，則不會(huì)受到影響，之后再添加Taq酶實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)變性步驟影響下，UNG就會(huì)失活，而新合成的包含有dU的PCR產(chǎn)物不會(huì)受到影響。

3.2.3 運(yùn)用紫外照射法

通過(guò)紫外照射能促使DNA中產(chǎn)生嘧啶二聚體，造成特定損傷，如DNA鏈斷裂，進(jìn)而使DNA結(jié)構(gòu)受到破壞，使其無(wú)法在實(shí)驗(yàn)中當(dāng)做PCR反應(yīng)模板。因此，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可以采用紫外照射法，對(duì)PCR污染源進(jìn)行消除處理。

如果通過(guò)上述方法仍不能有效消除污染，那么實(shí)驗(yàn)室需要考慮設(shè)計(jì)新引物，所設(shè)計(jì)的新引物需要和原引物不具備相關(guān)性，以此規(guī)避受原模板污染的影響，使對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物也能夠避免受到污染，從根源上消除實(shí)驗(yàn)受到污染的不良影響。

4 結(jié)論

動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)高度關(guān)注污染防治工作，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)操作的嚴(yán)格與規(guī)范。造成PCR污染的主要因素是PCR試劑污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、樣本交叉污染、操作者污染等，在實(shí)驗(yàn)操作期間每位操作者都應(yīng)當(dāng)保持嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的工作態(tài)度，認(rèn)真對(duì)待PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，有效規(guī)避實(shí)驗(yàn)中因個(gè)人操作不當(dāng)引發(fā)的污染。在PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展及不斷擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域的過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)不斷完善PCR污染的防控措施，使PCR技術(shù)能夠更安全有效地應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢疫及診斷。