賈晨 高峰 呂芳 楊靜 張園 王秀林 吳侖 王曉敏

（北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京） 北京 100176）

1 前言

氟喹諾酮類抗生素（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）是一類合成抗菌藥物，它們以細(xì)菌的DNA為靶，導(dǎo)致細(xì)菌的DNA出現(xiàn)不可逆損傷，達到抗菌的效果[1]。該藥物具有廣譜抗菌的作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，但由于部分養(yǎng)殖者對水產(chǎn)品中獸藥殘留的認(rèn)識不足，存在藥物過量使用和不嚴(yán)格執(zhí)行休藥期規(guī)定等問題，使得水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留超標(biāo)的情況時有發(fā)生。

2020年9月，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院、全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站聯(lián)合發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年1號、2號》中明確表示，恩諾沙星、環(huán)丙沙星為已批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥，且休藥期均為500度日（即當(dāng)水溫為25℃，至少需停藥25 d以上）；洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星在動物性食品中已停止使用，包括原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑；在農(nóng)業(yè)部公告193號中明確表示，氟羅沙星在動物性食品中的地方使用標(biāo)準(zhǔn)也已廢止。結(jié)合上述文件要求和產(chǎn)品監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目前水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中檢出甚至超標(biāo)的氟喹諾酮類抗生素主要為恩諾沙星、環(huán)丙沙星，其余幾種物質(zhì)均未檢出。

結(jié)果表明，部分氟喹諾酮類抗生素雖然可以在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中使用，但由于其溶解性較差、化學(xué)穩(wěn)定性強、在水中難于降解，長期使用會給水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境帶來安全隱患，特別是池塘養(yǎng)殖，很多養(yǎng)殖從業(yè)者多年都未清池，導(dǎo)致底泥中有大量的藥物殘留。抗生素還可在人體中進行累積，對人體器官產(chǎn)生蓄積毒性，從而危害人體健康。因此，近年來，由于過度使用此類藥物引起的環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題也成為研究熱門。本文針對底泥中氟喹諾酮類抗生素殘留的檢測方法進行綜述，以期為相關(guān)部門開展工作提供依據(jù)。

2 底泥中氟喹諾酮類抗生素檢測方法的研究進展

2.1 高效液相色譜熒光法

高效液相色譜法（HPLC）是采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。常見的檢測器有紫外檢測器（UV）、熒光檢測器（FLD）等[2]。HPLC具有高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、用量少、分析速度快等優(yōu)點[3]。

戴曉虎等[4]建立了細(xì)胞破碎，堿式提?。ㄈ野?甲醇/水以5/25/75混合），固相萃取富集（SPE），磷酸-三乙胺溶液為緩沖鹽流動相，甲醇為有機流動相，梯度熒光掃描的高效液相色譜—熒光（HPLCFLD）檢測方法。污泥中FQs的加標(biāo)回收率可達到71%～101%。

劉立早等[5]用高效液相色譜熒光法檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底泥中恩諾沙星、環(huán)丙沙星2種FQs殘留，選用5 mL 50%Mg（NO3）2-10%NH3·H2O（96∶4，v/v）作為提取液，樣品過HLB小柱富集凈化后，用酸化乙腈洗脫。洗脫液的濃縮方式選擇氮吹。在0.002～0.05 mg/L范圍內(nèi)2種FQs線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.999，回收率為74.8～92.2%，檢出限分別為0.47 μg/kg，0.71μg/kg。

陳莉等[6]測定的污泥樣品選用pH為3的乙腈：磷酸鹽緩沖液進行提取，利用HLB小柱進行凈化富集，通過甲醇洗脫、濃縮后HPLC-FLD檢測，采用乙腈/0.1%的甲酸作為流動相并以外標(biāo)法定量。FQs在0.05～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，R2為0.9927～0.9998。不同濃度（低、中、高）添加時，加標(biāo)回收率為78.3%～106.4%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.68%～12.06%。。

通過上述方法可以看出，檢測污泥、底泥中FQs采用的檢測器一般為FLD，F(xiàn)LD的靈敏度較UVD高出2～3個數(shù)量級。由于FQs分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且污泥、底泥成分復(fù)雜，在FQs多殘留檢測中采用程序波長法可以提高檢測的靈敏度和選擇性。

2.2 超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）

超高效液相色譜（UPLC）借助于HPLC（高效液相色法）的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。其分析過程效率更高、流動相消耗更少，更加適合批量樣品分析[7]。

王碩等[8]采用UPLC-MS/MS測定城市污水處理廠污泥中的50種抗生素，樣品經(jīng)乙腈-水溶液超聲萃取，高速冷凍離心后，提取液經(jīng)過HLB柱富集和NH2柱凈化；ACQUITY UPLC BEH C18柱用作色譜分離，以0.1%甲酸水溶液-甲醇（ESI+）和乙腈—水（ESI-）為流動相進行梯度洗脫；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行檢測；目標(biāo)藥物使用基質(zhì)外標(biāo)法定量。50種目標(biāo)藥物的線性范圍為0.50～400μg/L，相關(guān)系數(shù)均＞0.99。方法定量下限為0.10～5.00μg/kg，3個加標(biāo)水平下的回收率為40%～111%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～27.1%。

尹燕敏等[9]對沉積物樣品的前處理采用加速溶劑萃取。該方法在9min內(nèi)可完成目標(biāo)化合物的UPLC-MS/MS分離分析。對于沉積物，20種目標(biāo)化合物的檢出限分別介于0.005～0.2μg/kg之間，在各自考察的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.995）。

符靖雯等[10]應(yīng)用UPLC-MS/MS同時測定淤泥中氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和達氟沙星的殘留量，樣品以加入Na2EDTA的乙腈：磷酸鹽緩沖液（1∶1）（pH=3）作為提取劑，經(jīng)超聲處理、SAX-HLB串聯(lián)固相萃取小柱富集凈化，以Agilent C18色譜柱進行分離，在UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下檢測，基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4種氟喹諾酮類藥物在5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.998，方法檢出限為0.015～0.060μg/kg。回收率為70.4%～89.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.4%～9.4%。該方法適用于養(yǎng)殖場淤泥中4種痕量抗生素殘留檢測。

陳磊等[11]采用QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合UPLC-MS/MS和內(nèi)標(biāo)法，對色譜條件、提取條件、凈化條件進行優(yōu)化，19種抗生素的相關(guān)系數(shù)r2為0.992～0.998，在10、50、200μg/kg加標(biāo)水平下的回收率為65.2%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤14%。該方法操作簡單、快速、高效，具有很好的實用價值。

目前，UPLC-MS/MS開展對底泥、沉積物、土壤中FQs殘留的檢測應(yīng)用已成為趨勢，串聯(lián)質(zhì)譜可以消除基質(zhì)干擾，解決目標(biāo)物的定性和定量問題，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。

2.3 高分離快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（RRLC-MS/MS）

高分離快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（RRLC-MS/MS）因具有分離度高、操作時間短、靈敏度高的特點，已被用于測定人和獸藥類抗生素達50余種[12]。

呂凱等[13]建立的RRLC-MS/MS檢測河水和沉積物中的14種抗生素在5～100μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.990。優(yōu)化后的前處理方法采用乙腈/0.1mol/L的EDTA-Mcllvaine（1∶1，V/V）作為沉積物樣品中目標(biāo)抗生素的提取劑，甲醇/丙酮（85∶15，V/V）作為固相萃取柱的洗脫液。其中沉積物中14種抗生素的加標(biāo)回收率為57%～127%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）為0.10%～25%，方法檢出限為0.25～2.94 ng/g。

3 討論

隨著分析技術(shù)和新型材料的發(fā)展，HPLC-FLD、UPLC-MS/MS、RRLC-MS/MS等方法被應(yīng)用于污泥、底泥、沉積物中FQs殘留的檢測。此外，飛行時間質(zhì)譜在快速篩查方面也有較多應(yīng)用，但未有學(xué)者在底泥檢測方面做過相關(guān)研究，其具有廣泛的應(yīng)用前景，特別是在多種藥物的同時快速篩查方面具有很大的潛力。