宋麗影 李雨艷 周婷婷 路放

（吉林金域醫(yī)學檢驗所有限公司 吉林長春 130000）

1 前言

方法學性能驗證是指為確保實驗室開展的檢測項目中，所應用的檢測系統(tǒng)的分析性能或檢測項目的方法學能夠滿足檢測及臨床要求，進行的一項質量保證工作，只有通過性能驗證才能開展相關工作。HBV-DNA定量（實時熒光定量PCR方法）是分子實驗室中最常見的一種項目。本文以HBV-DNA定量檢測為例，對如何進行分子診斷定量項目的分析性能驗證進行簡要分析。

2 材料與方法

2.1 標本來源

HBV-DNA標本（吉林金域醫(yī)學檢驗所有限公司）；正確度驗證室間質評樣本（國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心，吉林市臨床檢驗中心）；重復性精密度和中間精密度驗證高低值室內質控品（北京康斯坦徹）。

2.2 儀器

實時熒光定量PCR儀（ABI7500）；DP-1OOO提取儀（上?？迫A生物技術有限公司）；5424R高速冷凍離心機（Eppendorf）。

2.3 試劑

乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒（磁珠/PCR-熒光探針法，國械注準20193401792，試劑批號20031611，上?？迫A生物技術有限公司）。

2.4 方法

2.4.1 正確度驗證

使用已經(jīng)通過室間質評的20例樣本進行驗證，計算出每個樣本的偏倚百分比，偏倚百分比=（測量值-理論值）／理論值×100%。留樣再測判斷標準：按照項目穩(wěn)定性要求，選取能夠覆蓋測量區(qū)間的最長期限的5個樣本，其中至少4個樣本的測量結果偏倚＜±7.5%。

2.4.2 精密度驗證

（1）重復性精密度：選取高低值質控品，在同一次實驗中重復檢測高低值質控品各20次，記錄結果并計算均值、標準差和變異系數(shù)CV（%）。以能力驗證／室間質評評價界限（靶值±0.4對數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度＜3／5TEa（TEa=0.4Lg），即為通過。

（2）中間精密度：選取高低值質控品，利用不同日期累計的20個測定值的數(shù)據(jù)，記錄結果并計算均值、標準差和變異系數(shù)CV（%）。以能力驗證／室間質評評價界限（靶值±0.4對數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），中間精密度＜4／5TEa（TEa=0.4Lg），即為通過[1]。

2.4.3 線性驗證

取臨床HBV-DNA混合血清定值為3.48E+06 IU/mL的樣本進行驗證，使用陰性血清10倍梯度稀釋至5、4、3、2次方。每個濃度重復檢測3次，用陰性標本按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000系列進行稀釋，以稀釋計算值作為理論值，對各稀釋樣品的實測值與理論值進行回歸分析，對每個樣本進行3次檢測，經(jīng)統(tǒng)計后擬合回歸線y＝bx+a。

2.4.4 抗干擾能力驗證

取2種不同濃度（E3和E5）的HBV血清樣本，將血清樣本和相應的干擾物進行一定比率的混合，混合后對應濃度分別為：膽紅素18 mg/mL，甘油三酯3 g/dL，血紅蛋白2 g/dL；按照相同的比率將混合血清和相應的干擾物空白對照（陰性血清）混合后再檢測。每個混合品重復檢測3次，計算均值（lg值）。評價標準：實驗樣本與對照樣本lg值偏倚＜±7.5%。

2.4.5 質控

每次實驗時均做陰性、低值與高值室內質控。在實驗結束時將低值與高值質控結果進行對數(shù)轉換并錄入系統(tǒng)。當質控結果理想時，實驗數(shù)據(jù)才能被采用，否則需要重新進行檢測[2]。

3 試驗結果

3.1 正確度驗證結果

試驗正確度驗證結果見表1。

表1 HBV-DNA正確度驗證結果

3.2 精密度驗證結果

3.2.1 重復性精密度

重復性精密度測定S低值為0.12，S高值為0.08，詳見表2。

表2 HBV－DNA重復性精密度驗證結果

3.2.2 中間精密度

中間精密度統(tǒng)計不同日期累積的S低值為0.11，詳見表3。

表3 HBV－DNA中間性精密度驗證結果

3.3 線性驗證結果

將3.48E+06 IU/mL濃度的樣本稀釋至3.48E+02 IU／m。

表4 HBV－DNA線性驗證結果

3.4 抗干擾能力驗證結果

本次實驗樣本與對照樣本的lg值偏倚均符合＜±7.5%的標準，驗證合格。

表5 抗干擾能力樣本定量值

4 討論

熒光定量PCR是實驗室最常用的檢測方法之一，具有高敏感性和特異性，被廣泛應用于臨床診斷和治療，在臨床分子診斷中展現(xiàn)出巨大的應用價值，檢測人員必須充分掌握其方法性能，并采取相應質控措施，才能確保實驗結果的準確性[3]。因此，本文通過對本實驗室開展的HBV-DNA定量檢測方法學性能驗證情況進行分析，為PCR檢測項目的方法學驗證提供設計方案。

熒光定量PCR檢測HBV-DNA方法的正確度驗證，可以采用室間質評結果或CAP能力驗證結果，驗證檢測方法的準確性和可比性，該方法更權威可靠，更具可比性[4]。精密度驗證可以使用第三方質控品或采用室內質控檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，由于質控是每天隨病人標本同時檢測，因此該方法既能夠節(jié)約成本，又能夠真實反映檢測系統(tǒng)的重復性，可以為精密度驗證評價提供更充分依據(jù)[5]。

表1和表3的驗證結果顯示，偏倚百分比均＜±7.5%。從線性驗證結果來看，5個濃度的樣本均檢出，相關系數(shù)R=0.9913，與理論值呈顯著的相關性。用于線性范圍驗證的樣本應覆蓋整個檢測系統(tǒng)的范圍，且樣本的稀釋和檢測都可能存在誤差，所以暫定1.00E+02為檢測下限，但并沒有得到具體的檢測上限，暫定線性范圍為1.00E+02～5.00E+08 IU/ml。由于抗干擾能力也會影響檢測準確性，故本文分別對黃疸、脂血、溶血樣本進行驗證，結果均與試劑生產(chǎn)廠家的聲明結果一致。

綜上所述，實驗室在開展PCR檢測項目前，需對正確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力等方法學性能進行驗證。本文驗證的方法學性能指標均能滿足預期臨床用途，表明本實驗室能夠為臨床工作提供有效支持。