廖太陽,王培民,張農山,吳 鵬,丁 亮?

(1.江蘇省中醫(yī)院,南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,南京 210029)

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)作為老年人常見的關節(jié)退行性疾病,衰老,勞損和外傷等復雜的因素都會影響滑膜和軟骨從而導致關節(jié)破壞和臨床一系列癥狀。 最近一項研究表明美國就有1400 萬人患有膝骨關節(jié)炎,值得注意的是,超過一半患者年齡在65 歲以下且女性比男性更易好發(fā)膝骨關節(jié)炎[1]。 目前認為KOA 屬于全關節(jié)疾病,其病理過程包括軟骨的進行性丟失和破壞、軟骨下骨硬化、骨贅形成、不同程度的滑膜炎癥、韌帶和半月板退變及整個關節(jié)囊的退變,臨床常見關節(jié)刺痛、短暫的晨僵、活動障礙,發(fā)展為終末期的殘疾不得不關節(jié)置換[2]。 盡管目前KOA 的發(fā)病機制尚未闡明,但是控制炎癥已成為目前治療KOA 的有效策略[3]。近些年來研究報道了NLRP3 炎癥小體(nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)參與OA 的發(fā)病過程,如Toll 樣受體(tolllike receptor,Toll)及核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路導致軟骨退變和滑膜炎癥。 本文將最新關于NLRP3 炎癥小體與KOA 關系的研究作一系統(tǒng)綜述,深入探尋KOA 炎癥發(fā)病機制,進一步完善KOA 病理機制。

1 NLRP3 炎癥小體信號通路

1.1 概述

NLRP3 炎癥小體首先被Martinon 等[4]描述為經半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine proteinase-1,Caspase-1)加工和激活炎性細胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的一種大型多聚體蛋白復合物。 NLRP3由三個域組成:氨基末端吡啶結構域(PYD),中央NACHT 結構域和富含羧基末端亮氨酸的重復序列(LRR)。 研究認為NACHT 中央結構域具有ATP 結合活性促進NLRP3 的寡聚化,LRR 結構域則與NACHT 結構域形成抑制性相互作用,PYD 結構域允許NLRP3 與其他炎癥小體蛋白相互作用[5]。NLRP3 炎癥小體是焦亡中被研究的最為透徹的亞型,其它亞型包括黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)、NLRP1 等[6]。 NLRP3 在細胞質中,模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)參與先天免疫主要通過識別病原相關分子模式(pathogen-related molecular patterns,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-related molecular patterns,DAMPs),進而激活NLRP3[7]。 NLRP3 炎癥小體由NLRP3 炎癥體感受器蛋白、凋亡相關的斑點樣蛋白ASC(含一個氨基末端PYD 和一個羧基末端CARD)及Caspase-1 前體蛋白組成,并且在巨噬細胞、樹突狀細胞和脾臟中性粒細胞容易發(fā)生NLRP3活化。 NLRP3 炎癥小體通路屬于經典炎癥小體焦亡途徑(Caspase-1 介導)、除此之外還存在非經典炎癥小體焦亡途徑(Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介導)及凋亡蛋白Caspase-3 介導的焦亡途徑。 在類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)[8]、阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)[9]等疾病中已有眾多的研究表明NLRP3 是其疾病發(fā)生發(fā)展的潛在機制,但在KOA 中仍屬于新興領域,有待深入研究。

1.2 NLRP3 炎癥小體的分子機制

NLRP3 炎癥小體是機體重要的免疫保護機制,可防止細胞因子過多產生對組織的損害,保護機體免受微生物感染和內源性危險信號的侵害,然而,失調和過度的炎癥反應可以造成的組織損傷和炎癥被認為是疾病發(fā)生的重要原因[10]。 NLRP3 炎癥小體的分子調節(jié)機制涉及翻譯后修飾(泛素化和磷酸化),蛋白激酶和自噬[11]。 如蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、NIMA 相關激酶7(nima associated kinase 7, Nek7) 等通過自身磷酸化來調節(jié)NLRP3[12]。 有學者認為自噬通過活性氧(ROS)的調節(jié),降解炎癥體成分、pro-IL-1β 和功能障礙的線粒體防治NLRP3 的過度激活,被認為發(fā)揮保護效應[13]。 然而,也有學者觀察到促進自噬可以抑制NLRP3 介導的炎癥反應,表明自噬可能促進OA 進程[14]。 已提出NLRP3 激活的兩個信號模型:第一步是在轉錄水平上啟動,其中TLRs 識別PAMPs 或DAMPs 以激活NF-κB 介導的信號傳導,這增加了pro-IL-1b,pro-IL-18 和NLRP3 蛋白的產量。 第二步是激活信號,該信號啟動NLRP3 寡聚并導致NLRP3,ASC 和pro-Caspase-1 聚在一起形成炎癥小體。 隨后pro-Caspase-1 發(fā)生自我剪切活化為Caspase-1 p10、Caspase-1 p20,Caspase-1 被活化過后能將pro-IL-1β、 pro-IL-18 剪切為成熟的白介素-1β、白介素-18 大量釋放至胞外,募集更多的炎癥細胞(HMGB1、白三烯、前列腺素等)導致炎癥的級聯(lián)放大[15]。

除此之外,對于NLRP3 炎癥小體活化,已提出了幾種分子機制,包括鉀離子流出,鈣離子信號,溶酶體破壞,線粒體功能障礙,代謝產物和反高爾基體。 鉀離子流出在ATP、成孔毒素、晶體、顆粒等因素刺激導致細胞內鉀的水平降低,在NEK7 作用下直接結合活化NLRP3[16]。 鈣離子信號具有協(xié)調K+外流,阻斷的Ca2+流通將抑制NLRP3 炎癥小體的組件和活化[17]。 溶酶體破壞釋放組織蛋白酶B 直接結合NLRP3 炎癥小體,并促進NLRP3 炎癥小體的活化[18]。 線粒體功能障礙和線粒體 ROS(mitochondrial ROS, mtROS) 和 線 粒 體 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的釋放是NLRP3 炎癥小體激活的另一個重要誘因,比如NLRP3 激活劑引起ROS 升高后, 硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)介導的氧化還原應激激活NLRP3 炎癥小體[19]。 另一項研究表明高爾基體通過線粒體相關內質網膜上的蛋白激酶D 信號傳導參與NLRP3 激活[20]。 此外,幾種感染性微生物(結核分枝桿菌等)被證明可以激活NLRP3 炎癥小體[21]。 最近調查還發(fā)現(xiàn)抑制NLRP3炎癥小體可以預防和減緩衰老的過程[22],總之,NLRP3 炎癥小體是機體面對細菌,真菌和病毒感染的關鍵宿主免疫防御機制,隨著研究的深入,NLRP3炎癥小體將為許多疾病的治療提供更多思路。

2 NLRP3 炎癥小體與KOA

2.1 NLRP3 炎癥小體與軟骨退變

軟骨退變是與KOA 最常見的病理改變,軟骨細胞(軟骨中唯一的細胞類型)合成并包裹在細胞外基質中。 在健康狀況下,軟骨細胞負責維持新的細胞外基質的合成與去除舊軟骨組織之間的平衡。軟骨處在密閉環(huán)境之中,獲取營養(yǎng)和氧氣較為困難,因此作為一種高度敏感的細胞,外在刺激造成的機械損傷而引起的炎癥通常會激發(fā)它們的活化并減少軟骨細胞的數(shù)量,這直接導致軟骨細胞調節(jié)作用的失衡,軟骨細胞進一步活化會促使促炎性介質和基質金屬蛋白酶的產生,造成軟骨不可逆的損傷及其它組織損害。 NLRP3 炎癥小體是組織損傷和修復的重要機制,深入研究背后的機制有望滿足受損軟骨組織修復的需要。

軟骨周圍的巨噬細胞在DAMPs 或者PAMPs 的影響下激活Caspase-1,釋放NLRP3 炎癥小體,軟骨表面釋放大量的白介素-1β、白介素-18,增加了軟骨細胞中促炎因子的釋放,炎癥因子的募集刺激軟骨細胞分泌引起軟骨分解代謝酶,如基質金屬蛋白酶13(metalloprateinase-13,MMP13)和血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs - 5,ADAMTS5)從而導致軟骨破壞[23]。 目前在KOA 領域中NLRP3 炎癥小體與軟骨的研究如下:

He 等[24]在研究較少的機械負荷與軟骨損傷的關系上發(fā)現(xiàn),較少的機械負荷通過減少NLRP3 炎癥小體的活化減輕了KOA 關節(jié)的軟骨破壞,軟骨下骨變化。 Yang 等[25]人利用生物信息學分析關節(jié)軟骨中與運動相關的基因發(fā)現(xiàn)適度的機械刺激可以通過抑制TRAIL/NF-κB/NLRP3 通路來改善軟骨退變和軟骨細胞損傷。 Zu 等[26]在碘乙酸鈉處理的Wistar 大鼠KOA 的模型中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷通過抑制NLRP3 / Caspase-1 信號傳導途徑改善軟骨損傷從而減輕了KOA 的病理改變。 Xu 等[27]在小鼠半月板失穩(wěn)模型中發(fā)現(xiàn)MMP-13,NLRP3 表達升高,關節(jié)內注射雷帕霉素可抑制NLRP3 活性并預防骨關節(jié)炎。 Gao 等[28]研究發(fā)現(xiàn)氯雷他定治療后減輕了SW1353 軟骨細胞中的氧化應激,同時抑制了TXNIP 和NLRP3 炎癥小體復合物的表達。 Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸通過NF-κB/ NLRP3 炎癥小體途徑可改善大鼠前交叉韌帶橫斷誘導的OA,改善軟骨退變。 綜上可以發(fā)現(xiàn),盡管這一兩年涌現(xiàn)出不少關于OA 軟骨與NLRP3 炎癥小體的研究,比如在機械應力/刺激方面作用下軟骨與NLRP3 炎癥小體,不同KOA 模型軟骨損傷與NLRP3 炎癥小體關系,不同的治療方式通過NLRP3 炎癥小體或與其它作用途徑的串聯(lián)緩解軟骨損傷,甚至與微小RNA、氧化應激、外泌體、衰老、自噬等聯(lián)系起來,盡管大多研究停留在表面,但可以預料隨之研究的持續(xù)深入,NLRP3 炎癥小體與軟骨退變的研究未來會有更令人驚喜的發(fā)現(xiàn)。

2.2 NLRP3 炎癥小體與滑膜炎癥

滑膜炎癥是軟骨退變的重要原因之一,參與軟骨降解的IL-1β 可能是滑膜細胞產生的而不是軟骨細胞。 滑膜炎癥在RA 研究相對較多,遺傳學研究已經證明RA 滑膜組織編碼NLRP3 炎癥體成分(包括NLRP3、ASC 和Caspase-1)的基因顯著上調[30]。此外,KOA 患者滑膜中NLRP3 的蛋白水平表達量是正?；颊叩?.4 倍以上[31]。 在KOA 患者滑液中發(fā)現(xiàn)滑液尿酸水平與滑液IL-18 和IL-1β 密切相關,認為滑液尿酸可作為評價KOA 嚴重程度的標志之一,而已知尿酸可以激活NLRP3,這說明滑液NLRP3、尿酸和炎癥因子存在復雜的關系網絡[32]。總之,在骨性關節(jié)炎滑膜巨噬細胞中,炎癥小體,如NLRP3,在不同的DAMPs 作用下被誘導并釋放到滑液,關節(jié)液和周圍組織中。 在滑膜巨噬細胞和軟骨細胞參與的一系列炎癥反應中增加了IL-1β 水平,刺激產生更多的促炎細胞因子。

近些年文獻報道了NLRP3 炎癥小體與滑膜炎癥的研究。 Zhao 等[33]較早的在KOA 患者滑膜中發(fā)現(xiàn)NLRP1 和NLRP3 炎癥小體參與成纖維樣滑膜細胞(FLS)焦亡。 Chen 等[34]也在KOA 患者的滑膜組織中發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1 信號可能是激活NLRP3 炎癥小體的關鍵途徑。 Li 等[35]則發(fā)現(xiàn)蔓荊子黃素可通過抑制HIF-1α/ NLRP3 炎癥小體激活來減輕MIA誘導的KOA 滑膜炎癥。 Xiao 等[36]進一步研究發(fā)現(xiàn)NLRP1 和NLRP3 炎癥小體介導的FLS 焦亡可以增強高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的分泌,有望為減少KOA 滑膜炎癥提供新的治療策略。 此外,miR233 調控NLRP3 炎癥小體參與滑膜損傷,這可能是KOA 發(fā)病的重要機制[37]。 有學者深入研究膝關節(jié)缺氧環(huán)境與NLRP3炎癥小體為代表的焦亡研究中指出,膝關節(jié)炎癥缺氧導致缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)升高,導致NLRP3、Caspase-1、GSDMD等表達升高,進而加重KOA 滑膜炎癥及纖維化[38-39]。 有研究表明靶向NLRP3 途徑可能是某些中醫(yī)藥發(fā)揮療效的機制,如“易層”貼敷療法可通過NLRP3/Caspase-1 炎癥小體通路治療KOA 滑膜炎癥,改善膝關節(jié)外周痛敏[40-41]。

在2016 年Clavijo-Cornejo 等[31]發(fā)現(xiàn)NLRP3 在KOA 患者滑膜中升高這5 年以來,關于NLRP3 炎癥小體與滑膜炎癥的研究逐漸增多,尤其是這兩年,說明這一研究正得到大家廣泛的興趣。 但是研究仍較少,NLRP3 炎癥小體在KOA 的深入研究有待于進一步發(fā)現(xiàn),尤其是需要使用更高級的技術,去探究細胞內部的結構及與不同分子間的相互作用,更需要開展更多的動物實驗將滑膜與更多的組織(如軟骨組織、髕下脂肪墊等)聯(lián)合起來共同研究,探究不同組織甚至器官間的Crosstalk 作用及機制。 此外,滑膜炎癥作為藥物開發(fā)的重要方向,要利用更高級的技術闡釋背后的機制及開發(fā)針對NLRP3 炎癥小體靶點的藥物,以期做到早期診斷、早期干預及有效預防干預滑膜炎癥。

2.3 NLRP3 炎癥小體與KOA 疼痛

疼痛是KOA 最典型的癥狀之一,來自外界的傷害刺激信號能夠敏化中樞神經和外周神經,并伴有大量炎癥性和非炎癥性病理狀態(tài)。 NLRP3 炎癥小體已牽涉到許多痛苦的疾病和病癥,比如膀胱疼痛,神經性疼痛,類風濕性關節(jié)炎,痛風,偏頭痛等[42]。 關于疼痛的機制在此不再贅述,我們只簡單討論在NLRP3 炎癥小體導致疼痛激活的機制以及抑制NLRP3 炎癥小體介導鎮(zhèn)痛作用。 NLRP3 炎癥小體的激活導致的疼痛可能跟炎癥因子的釋放與募集有關,IL-1β 釋放后,可能通過改變幾種神經元離子通道和受體的功能來增加傷害感受器的興奮性,因此IL-1β 被認為是一種神經調節(jié)劑。 此外IL-1β 還介導內源性分子的產生進一步促進外周致敏作用,例如神經生長因子(nerve growth factor,NGF),前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和降鈣素基因相關肽[43]。 NLRP3 的激活還導致活性白介素18 的釋放,已發(fā)現(xiàn)IL-18 可導致肌肉疼痛,癌癥引起的骨痛[44-45]。 關于抑制NLRP3 炎癥小體介導鎮(zhèn)痛研究上,有研究報道MCL950 作為一種特定的NLRP3 拮抗劑,可減輕機械性異常疼痛,升高脊髓中的NLRP3,ASC,Caspase-1 和IL-1β 的表達水平[46]。

大多數(shù)KOA 疼痛是由周圍神經的變化引起的,正常情況下,神經傷害性感受器位于特定的組織中,只能檢測到本區(qū)域的感覺。 在OA 的發(fā)展過程中,過量的炎癥因子、細胞因子、趨化因子、機械刺激和過度的感覺和交感神經支配導致傷害性刺激信號的擴大[47]。 炎癥小體上調促炎細胞因子的產生,增加關節(jié)組織的傷害性刺激信號,導致疼痛的持續(xù)放大以致難以忍受,這個過程被稱為“痛覺過敏”。 此外,在炎癥小體導致的慢性炎癥中,受損害的是整個關節(jié),這包括軟骨破壞、滑膜炎癥、骨贅的產生及骨的破損,這些病理改變伴隨異常血管和神經網絡的生成,由于神經的生長比血管緩慢,新形成的血管神經支配減少,更易受到化學和機械刺激導致OA 疼痛[48]。 針對KOA 疼痛,有學者提出從TRP 離子通道出發(fā)控制外周疼痛具有治療意義[49]。但是目前在KOA 領域仍然缺乏NLRP3 炎癥小體引發(fā)疼痛的高質量證據,僅從表型觀察到通過NLRP3炎癥小體通路可以抑制炎性疼痛、改善大鼠疼痛樣行為和降低疼痛因子表達[50]。 我相信探究NLRP3炎癥小體與疼痛的研究正在受到重視,未來會有更深入的調查。

3 結論和展望

綜上所述,NLRP3 炎癥小體參與了KOA 軟骨退變、滑膜炎癥及疼痛的發(fā)生,NLRP3 炎癥小體及調控的細胞因子是KOA 治療有希望的靶點,但是有必要進一步在KOA 中闡明NLRP3 激活和調節(jié)的機制。 膝骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展除了軟骨和滑膜的作用外,軟骨下骨、關鍵韌帶和肌肉也發(fā)揮了重要作用,并且伴隨病變,所以將NLRP3 與這些關鍵組織的退變關系聯(lián)系起來將是未來研究的重要方向。此外,進一步的研究應該集中在軟骨細胞、滑膜細胞和其他非巨噬細胞的機制上,以闡明這一細胞死亡過程是如何在細胞中介導的,提高我們對NLRP3炎癥小體介導KOA 發(fā)生機制的理解,幫助闡明KOA 發(fā)病的機制。 總體而言,NLRP3 炎癥小體及調控的細胞因子是診斷和監(jiān)測KOA 的一個有效生物標志物,針對NLRP3 的藥物開發(fā)及治療可能是KOA 的潛在的策略。