陳雨然,劉 莉,李龍雪,洪 滔?,劉隆霸,楊志龍,程 洪,劉志勇,3?

(1.江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心,南昌 330004;2.江西醫(yī)療服務指導中心,南昌 330006;3.江西省中藥藥理學重點實驗室,南昌 330004)

隨著人類生活水平的提高和生活節(jié)奏的加快,由于長期的飲食不節(jié),導致肥胖、高脂血癥急劇增加,中醫(yī)認為由于肥甘厚膩的飲食導致脾胃運化失調,以致攝入的水谷精微不能轉化成我們身體需要的能量和營養(yǎng),而是轉化成痰濕,淤積在體內,若脾胃功能失常,飲食水谷不能正常的輸布,則聚而成痰、成飲,留貯體內漸成肥胖[1-2]。 可見肥胖、高脂血癥的發(fā)生與形成與脾胃關系密切,“脾主運化,輸布水谷精微,胃主受納,腐熟水谷”,脾胃消化、吸收、輸布功能正常,則水液輸布正常,異常則水濕不化,聚而生痰[3-4]。 而中藥江香薷,干燥地上部分入藥,既能調中溫胃,又能健脾化濕,還能開宣肺氣而利水消腫[5-7],有實驗發(fā)現(xiàn)香薷揮發(fā)油能改善由于飲食不節(jié),潮濕環(huán)境,強迫游泳方法建立的濕困脾胃證大鼠的胃腸氣機,調節(jié)水液代謝和機體免疫,提高中焦脾胃健運發(fā)揮治療作用[8],為探討江香薷水提液是否對高血脂大鼠的胃腸生理生化、水液代謝和機體免疫有影響,故而本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)大鼠形成高脂血癥模型,然后用江香薷水提液灌胃,來探討江香薷對高脂血癥大鼠胃腸道生理生化及免疫的影響,為江香薷更好在中醫(yī)藥及中獸藥領域的應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗大鼠為SPF 級雌性SD 大鼠30 只,體重200~220 g,由江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[SCXK(贛)2018-0001],大鼠飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學實驗動科中心無特定病原體級屏障系統(tǒng)內[SYXK(贛)2017-0004],環(huán)境溫度為(21±1)℃、相對濕度46%~56%,飲水自由采集。 項目實施通過了江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的審查(JZLLSC2019-0157),并嚴格遵守實驗動物的3R 原則給予實驗大鼠人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

江香薷(批號:180823)購自江西江中中藥飲片有限公司;江香薷水煎液,江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑組代煎,批號:121223,規(guī)格:1 g(生藥)/1 mL,具體制備方法:1000 g 江香薷飲片加水10 L 水,浸泡1 h,煎煮,水提2 次,合并兩次濾液,濃縮至1 ∶1液,即為1 g(生藥)/1 mL 藥液,無菌密封4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清腺苷脫氨酶(ADA)、尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素(UREA)、總膽汁酸(TBA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白(LDL)、巖藻糖苷酶(AFU)、脂蛋白(a)(LP(a))試劑盒由上海科華試劑公司提供;血清胃動素(MTL)試劑盒、胃泌素(GAS)試劑盒、淀粉酶(AMS)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒、水通道蛋白2(AQP2)試劑盒、Na+-K+-ATP 酶試劑盒由上海赫澎生物科技有限公司提供;2%藍色葡聚糖2000(DB-2000)。

全自動生化儀(貝克曼AU480); 酶標儀(Thermo);顯微鏡(IX37 生物顯微鏡);電子天平(AUY120 島津分析天平)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模與分組

30 只大鼠檢疫室里適應性飼養(yǎng)7 d,Excel 輔助下的隨機數(shù)字法將其分為空白對照組6 只和余下24 只為高脂模型制作組。 6 只空白組給予湖北萬千佳興基礎飼料(蛋白含量為20%),給予模型制作組大鼠高脂飼料,采用湖北萬千佳興的基礎飼料,含量為79%,在這個基礎料的基礎上加入10%高膽固醇的豬油油脂、10%膽固醇、1%膽鹽形成高血脂的造模飼料,四周后眼眶靜脈叢采血檢測血脂水平,根據(jù)甘油三酯水平留下18 只作為高脂血癥的大鼠模型,再隨機分為高血脂模型對照組、江香薷水提液高劑量及其低劑量組,每組6 只。 江香薷水提液高劑量為1 g/kg,低劑量為0.2 g/kg,灌胃量為1 mL/100 g,每天一次,每周記錄一次大鼠體重,并調整江香薷的給藥量。

1.3.2 實驗動物臨床表現(xiàn)的觀察

實驗期間,各組采食、飲水、活動正常,但模型組毛發(fā)粗糙,江香薷低、高劑量組毛發(fā)潔白光亮。

1.3.3 血常規(guī)檢測

實驗結束,取血500 μL,5 分類動物血球計數(shù)儀檢測血常規(guī)。

1.3.4 血清生化指標檢測

實驗結束,取血2 mL,貝克曼480 全自動生化分析儀檢測肝腎功能,血糖血脂指標。

1.3.5 腸胃指標的測定

(1)胃排空及小腸推進度試驗。 參考文獻[8]方法進行。

實驗前禁食不禁水16 h,然后按每只大鼠0.4 mL 給予2%藍色DB-2000(葡聚糖2000)灌胃,30 min 后對胃和小腸進行取材。 將取下的小腸攤平于平整的板上,先量取幽門括約肌至色素最前端的距離,然后量取幽門括約肌至盲腸的距離,據(jù)此計算小腸推進率。 小腸推進率=小腸內色素推進的長度值/全小腸長度值×100%

(2)腸管含水量的測定

大鼠取血后處死,取大腸5 cm 左右,在生理鹽水中輕輕晃動腸道以洗去腸管中的食物殘渣以及殘留血液,然后用濾紙請按擦干,再放置于一張潔凈的濾紙上,連同濾紙進行稱重并記錄,稱重后的腸管標本送入烘箱中,60℃下恒溫烘干10 h,10 h 后取出再次連帶濾紙一同稱重并記錄第二次的值,按如下公式計算即位腸管含的水量。 腸管含水量=(大腸濕質量-大腸干質量)/大腸濕質量×100%。

(3)血清胃動素、胃泌素、淀粉酶活性、AQP2 和能量代謝指標的檢測

大鼠采用股動脈放血法采血,收集于生化采血管中,室溫下斜面靜置,然后以轉速3000 r/min 的離心機內離心10 min,仔細分離上層血清,置-80℃冰箱保存,按照ELISA 試劑盒說明書操作測量血清胃動素和胃泌素和Na+-K+-ATP 酶、淀粉酶活性和水通道蛋白2(AQP2)測定。

1.3.6 免疫學和炎癥因子的檢查

血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、補體(C3、C4)的檢測。

同上處理的血清,貝克曼全自動生化分析儀檢測IgA、IgM、IgG、C3、C4 水平,按照ELISA 試劑盒說明書操作測量血清IL-6 和TNF-α 的水平。

1.3.7 胸腺及脾臟器系數(shù)的測定和主要臟器的病理學觀察

實驗結束,胸腺和脾臟器系數(shù)的獲取,動物處死后將胸腺及脾及時取出,分離干凈后用濾紙吸去血污,立即在電子天平上稱取重量,記錄數(shù)值并按如下計算公式計算臟器系數(shù):臟器系數(shù)=臟器質量(克)/體重(克)×100%。 心、肝、肺、胃、腸道等主要臟器無明顯大體改變,將解剖后的臟器固定福爾馬林溶液中24 h 之后沖洗、脫水、石蠟包埋固定后制片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察臟器是否存在顯微變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以Excel 建表后,使用IBM SPSS 20 應用軟件進行組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗,采用單因素ANOVA檢驗體重、血常規(guī)、血生化指標、ELISA 數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果以平均數(shù)±標準差(±s)表示,作圖軟件用GraphPad Prism 8.0.2 應用軟件。

2 結果

2.1 造模分組血脂水平和灌服江香薷后血脂的變化

由表1 可見,造模4 周后給藥前各組的TCH 水平明顯高于正常對照組,灌胃江香薷后TG,TCH 和LDL 水平與模型組比較有所降低,且差異顯著P<0.05,而對HDL 的影響不大。

表1 造模分組血脂水平和灌服江香薷后血脂的變化Table 1 Blood triglyceride content after model establishment and effects of MCM on reducing blood lipid in rats

2.2 江香薷對高脂血癥大鼠體重的影響

各個試驗組在給藥期間均無死亡,各個試驗組在喂養(yǎng)過程中,體重呈遞增狀態(tài),但是江香薷給藥組在給藥4 周后體重與模型組比較開始呈下降狀態(tài),差異顯著(P<0.05),見圖1。

圖1 各組實驗大鼠實驗期間體重變化Figure 1 Changes in body weight of experimental rats in each group during the experiment

2.3 血液常規(guī)檢測結果

血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)與對照組相比模型組江香薷組大鼠的紅細胞、白細胞、血小板、均無明顯變化,見表2。

表2 灌胃江香薷后各組大鼠血常規(guī)的影響Table 2 Effects of blood routine of rats in each group after administering MCM

2.4 血清檢生化指標測結果

2.5 腸含水量和推進度指標的變化

高脂飲食導致腸道的水液積聚,含水量增加,推進能力減慢,見圖3。 給江香薷后大腸含水量下降,推進速度增加。

圖3 各實驗組大鼠在食用江香薷后腸道相關指標的影響Note. Compared with the normal control group, ?P<0.05. Compared with the high fat model group, #P<0.05.Figure 3 Effects of intestinal related indexes of rats in each experimental group after fed with MCM

2.6 血清胃腸動力學指標

高脂飲食導致腸道動力學指標改變,其中血清胃泌素(GAS)、淀粉酶(AMS)水平下降,而血清胃動素水平(MTL)升高,灌服江香薷后血清胃泌素(GAS)、淀粉酶(AMS)水平升高而降低了胃動素水平,見圖4。

圖4 江香薷對高脂血癥大鼠的血清胃腸動力學指標的影響Note. Compared with the control group, ?P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 4 Effect of MCM on serum gastrointestinal kinetics in hyperlipidemia rats

2.7 腸道水通道蛋白和Na+-K+-ATP 酶含量檢測結果

如圖5 所示,與正常對照組比較,高脂模型組大鼠血清Na+-K+泵的活性減弱,水通道AQP2 含有量增加,差異達到統(tǒng)計學的顯著性差別(P<0.05) ; 與高脂模型組比較,江香薷水提液給藥組大鼠血清Na+-K+-ATP 泵活性有所增加,高劑量的江香薷組與正常對照組無差別;AQP2 水平低于模型組(P<0.05) 。

圖2 各組實驗大鼠喂食江香薷后血清生化指標的影響Note. Compared with the normal control group, ?P<0.05. Compared with the high fat model group, #P<0.05.Figure 2 Effects of serum biochemical indexes of experimental rats in each group fed with MCM

圖5 江香薷對各組大鼠血清Na+-K+-ATP 酶活性和AQP2 的影響Note. Compared with the control group, ?P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 5 Effect of MCM on serum Na+-K+-ATPase activity and AQP2 of rats in each group

2.8 免疫學檢測結果

江香薷對大鼠血清白介素IL-6、免疫球蛋白IGM、C3 補體的含有量影響,對疫球蛋白IGA、免疫球蛋白IGG、補體C4 無影響,與正常對照組比較,高脂模型組大鼠血清白介素IL-6 增加,免疫球蛋白IGM、C3 補體含量減少,與高脂模型組比較,江香薷給藥組大鼠血清IL-6、IGM、C3 含有量減少,結果見圖6。

圖6 江香薷對各組大鼠血清免疫及炎癥因子的影響Note. Compared with the control group, ?P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 6 Effects of MCM on serum immune and inflammatory factors in each group of rats

2.9 脾肝病理組織觀察結果

各組的脾肝光學顯微鏡下基本正常,如圖7。

圖7 各組脾和肝均未發(fā)生明顯病理變化。Figure 7 No obvious pathological changes occurred in the spleen and liver in each group

2.10 江香薷對大鼠胸腺及脾系數(shù)的影響

如圖8 所示江香薷對大鼠胸腺和脾系數(shù)有影響,與對照組相比模型組和給藥組的胸腺和脾系數(shù)有所減小,但與模型組相比隨著給藥量的增加胸腺和脾系數(shù)增大,但差異不顯著(P>0.05)。

圖8 江香薷對各組大鼠的脾和胸腺指數(shù)的影響Figure 8 Effect of MCM on the spleen and thymus index of each group of rats

3 討論

中藥或藥食兩用中藥中有不少具有降血脂作用[9-10],江香薷屬于藥食兩用類中藥[11],它具有溫胃和中、健脾化濕、發(fā)汗利尿等藥理作用,臨床上常用于治療急性腸胃炎[12]、脾胃濕困等。 本實驗結果高脂飲食后大鼠血脂水平升高,江香薷水提液顯著降低了膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平,體重明顯低于模型組,顯示江香薷水提液可以明顯改善由于高脂飲食導致的癥狀。 高脂飲食導致大鼠胸腺和脾臟體比減少,灌胃不同劑量江香薷水提液后,大鼠胸腺和脾臟體比增加,顯示江香薷可以提高脾和胸腺的臟器系數(shù),提示江香薷有一定的增加免疫器官重量的能力。

小腸推動實驗能很好的反應大鼠的腸胃動力功能,本實驗結果表明高脂飲食后大鼠的腸胃動力功能減弱而江香薷能明顯改善模型大鼠的腸胃動力功能,提高大鼠脾胃的運化功能。 胃動素(MTL)是消化道激素之一,可以刺激胃運動,促進胃排空,胃泌素(GAS)是一種胃腸黏膜細胞分泌的胃腸激素,有促進食道括約肌收縮以及抑制小腸對水鹽的吸收作用,本實驗結果表明MTL 和GAS 有的上升趨勢,1,4-α-D-葡聚糖水解酶是淀粉酶的全稱,胰腺與唾液腺都分泌,該酶可以催化淀粉及糖原的水解,因而成為反應脾胃功能的重要指標之一,江香薷水提液灌胃后淀粉酶的活性明顯增強,提示江香薷水提液能明顯改善模型大鼠腸胃功能。 Na+-K+-ATP 泵在機體水液代謝、物質轉運、能量轉換等生理過程中發(fā)揮著重要作用,且江香薷揮發(fā)油灌胃給藥組大鼠的Na+-K+-ATP 酶活性增加,綜合以上結果表明江香薷能明顯改善高脂模型大鼠脾胃功能。

江香薷作為一種價格經濟、自然來源廣泛的常用中藥,前期的工作發(fā)現(xiàn)香薷揮發(fā)油有很好的藥理藥效作用,能用于改善濕困脾胃中的胃腸道功能,但揮發(fā)油的提取目前得率為0.6%[6],利用揮發(fā)油成本較高,本研究結果顯示江香薷水提液對高脂血癥大鼠的脾胃功能同樣具有很好的改善作用,由于水提液的制備和獲取量大,對江香薷的臨床保健功能開發(fā)和中獸醫(yī)獸藥的進一步開發(fā)應用提供了良好的技術支撐。