惠超杰李文輝曹立新慕莉蓉

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西寧 810001; 2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院干部保健科,西寧 810001)

大腦是人體對(duì)缺氧最為敏感的器官,腦組織缺血的情況下會(huì)導(dǎo)致大腦局部組織及其功能的損害,損害的程度大多數(shù)和缺血時(shí)間的長(zhǎng)短以及殘存血流量的多少有著一定的關(guān)聯(lián)[1]。 短期的不完全缺血只會(huì)引起可逆性的損害,長(zhǎng)時(shí)間的完全缺血或嚴(yán)重性缺血會(huì)引起梗死,組織學(xué)病變下最明顯的組織學(xué)變化是腦水腫以及細(xì)胞的壞死[2]。 腦缺血在一定時(shí)間后恢復(fù)血供,其功能不但不會(huì)出現(xiàn)恢復(fù),反而會(huì)出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦功能障礙,該癥狀被稱之為腦缺血-再灌注損傷[3]。 腦缺血-再灌注損傷是一個(gè)包括花生四烯酸代謝障礙在內(nèi)的一種多因素參與的較為復(fù)雜的病理過(guò)程,其中包括了缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷[4]。 本研究中建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,靶向調(diào)控AQP-4,旨在探究下調(diào)AQP-4 對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40 只清潔級(jí)SD 健康雄性大鼠購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司[SCXK(粵)2020-0055],大鼠飼養(yǎng)在青海省大學(xué)附屬醫(yī)院[SYXK(粵)2020-0242],體重210~243 g,平均(226.5±13.2)g。 在12 h 光照,濕度45%~55%,溫度25℃環(huán)境下喂養(yǎng)大鼠一周。 本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)((2020)年倫審(45)號(hào)),且遵守3R 原則進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠AQP-4 抗體(Hyclone 公司;貨號(hào):PAB28892);大鼠抗大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α 抗體( Selleck 公司; 貨號(hào): ATA31401; FNab04283;ATA38860);大鼠抗兔BMP4、P-Smad 抗體(Gibco公司;貨號(hào):FNab00919;H00004091-B01P);Na+、Pdp 試劑盒(南京建成生物工程研究所;貨號(hào):CKE10708;FT-P91045 T)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模及分組干預(yù)

隨機(jī)選取10 只大鼠作為本文研究正常組,不做任何處理。 其余30 只大鼠建立腦缺血再灌注損傷模型:對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉干預(yù)后固定,頸中皮膚剪開,將頸內(nèi)、外動(dòng)脈、左側(cè)頸總動(dòng)脈暴露于手術(shù)視野之中并分離,結(jié)扎頸外動(dòng)脈、翼腭窩。 使用線栓對(duì)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端切口至頸內(nèi)動(dòng)脈2 cm 處進(jìn)行穿線,對(duì)腦組織中動(dòng)脈近端血流進(jìn)行阻塞,2 h 后去除線栓并再灌注1 d。 將30 只腦缺血再灌注損傷大鼠隨機(jī)分為模型組、上調(diào)AQP-4 組、下調(diào)AQP-4 組各10 只,上調(diào) AQP-4 組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agoAQP-4,下調(diào)AQP-4 組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagoAQP-4,正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.3.2 大鼠腦組織含水量測(cè)定

選取相同時(shí)間點(diǎn)各組各1 只大鼠,處死后提取完整腦部,分批處死,切除前端的嗅球以及后部的小腦和腦干,隨后沿大腦的正中線切開,提取左側(cè)的半腦組織,使用電子分析天平對(duì)半腦組織進(jìn)行稱量濕重,稱重后記錄,隨后防止紅外線干燥箱內(nèi)進(jìn)行烘干,直至恒重,干重后再次進(jìn)行測(cè)量記錄并進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算公式為:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)

提前準(zhǔn)備高50 cm、直徑150 cm 的圓形水池,在水池內(nèi)標(biāo)注4 個(gè)點(diǎn)位,標(biāo)注好之后注入半池溫水,水溫為25℃。 隨后在水池中央內(nèi)放入高30 cm、直徑10 cm 的平臺(tái)。 分別于已標(biāo)記的4 處點(diǎn)位在造模成功后1 周后將大鼠置于水中,統(tǒng)計(jì)各組大鼠自如水點(diǎn)游至預(yù)置平臺(tái)時(shí)間,將120 s 內(nèi)未游至平臺(tái)的大鼠引至平臺(tái)之上,將潛伏期記為120 s,大鼠在平臺(tái)上停留30 s 之后,再將其放置其他不同入水點(diǎn)進(jìn)行重新測(cè)試。 所有大鼠均連續(xù)測(cè)試4 d,在第5 天時(shí)將平臺(tái)撤除,將大鼠從入水點(diǎn)放至水中,記錄60 s 以內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.4 制作標(biāo)本和HE 染色

標(biāo)本制作:取各組大鼠尾部靜脈血2 mL,離心處理15 min 后分離上清液,放置-80℃環(huán)境下保存待測(cè)。 各組大鼠麻醉處死,提取大鼠海馬區(qū)組織,固定浸泡至4%甲醛中,于24 h 后行常規(guī)石蠟包埋以及連續(xù)切片。

HE 染色:將切片烤干后,進(jìn)行包埋脫蠟處理,處理后順序置入不同濃度的乙醇中個(gè)復(fù)水3 min。隨后使用蘇木精染色15 min 后進(jìn)行清洗,清洗3 次后使用鹽酸乙醇分化處理30 s,充分清洗后使用1%伊紅進(jìn)行染色,使用乙醇進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理,封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.5 各組大鼠TNF-α、IL-1β 水平檢測(cè)

使用散射比濁法檢測(cè)TNF-α、IL-1β 水平:根據(jù)待檢驗(yàn)TNF-α、IL-1β 中提取的血清樣品在凝固的過(guò)程中發(fā)生變化的散射光確定檢測(cè),在光探檢測(cè)器為九十度直角的單色光源中向血清樣本加凝血激活劑,在樣品凝塊的過(guò)程中,散射光的強(qiáng)度會(huì)慢慢增加,當(dāng)血清樣本完全凝固后,光探測(cè)器會(huì)發(fā)生變化,會(huì)送到檢測(cè)器上處理并且描出凝固曲線后檢測(cè)TNF-α、IL-1β 的變化。

1.3.6 Na+、P-dp 含量檢測(cè)

大鼠處死后取腦組織,去掉嗅球、小腦和地位腦干,在冰上將大腦組織按照1 ∶9的生理鹽水制成10%的組織均漿進(jìn)行離心處理,離心后提取上清液隨后使用試劑盒測(cè)定,測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.7 AQP-4、BMP4、P-Smad 表達(dá)檢測(cè)

使用Western blot 法檢測(cè)AQP-4、BMP4、P-Smad表達(dá):首先使用PBS 緩沖液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行沖洗,隨后裂解30 min,裂解后測(cè)定其蛋白濃度。 取20 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳,電泳的同時(shí)加入蛋白緩沖液,10 min后把電轉(zhuǎn)膜放置到濃度為10%的牛奶中進(jìn)行浸泡,常溫環(huán)境下封閉2 h。 封閉后結(jié)合一抗孵育1 d,第2 天取出后使用TBST 液進(jìn)行沖洗,隨后結(jié)合二抗。1 h 后進(jìn)行清洗、顯色,對(duì)蛋白AQP-4、BMP4、PSmad 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件分析。 計(jì)量資料使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行描述,兩組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以%表示,兩組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn),多組對(duì)比行聯(lián)合假設(shè)檢驗(yàn)(F檢驗(yàn))檢驗(yàn),以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

如表1 所示,與正常組比較,其他三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期較長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)較低(P<0.05);與模型組和上調(diào)AQP-4 組相比,下調(diào)AQP-4組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期較短、穿越平臺(tái)次數(shù)高(P<0.05)。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of learning and memory abilities of rats in each group

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of learning and memory abilities of rats in each group

注:與正常組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與上調(diào)AQP-4 組相比,cP<0.05。Note. Compared with normal group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with the upregulated AQP-4 group, cP<0.05.

組別Groups逃避潛伏期(s)Avoiding the incubation period第1 天Day 1第2 天Day 2第3 天Day 3第4 天Day 4穿越平臺(tái)次數(shù)(次)Number of crossing platforms (times)正常組Normal group 34.58±3.25 29.85±3.25 24.55±2.25 19.92±2.54 1.85±0.26模型組Model group 43.87±5.13a 38.62±3.95a 33.34±3.25a 28.65±3.30a 1.21±0.19a上調(diào)AQP-4 組Upregulated AQP-4 group 53.29±5.25ab 46.32±5.31ab 41.15±5.01ab 38.64±5.15ab 0.86±0.11ab下調(diào)AQP-4 組Downregulated AQP-4 group 38.56±3.25abc 34.22±3.35abc 27.61±2.97abc 22.39±2.58abc 1.64±0.32abc F 32.134 12.548 14.337 15.464 16.634 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2 各組大鼠腦組織病理HE 染色圖

如圖1 所示,正常組大鼠腦組織細(xì)胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完好,細(xì)胞核較為清晰。 模型組與上調(diào)AQP-4組腦組織細(xì)胞排列順序錯(cuò)亂,細(xì)胞核出現(xiàn)破裂情況,并且伴隨著水腫的存在,炎癥細(xì)胞入侵。 下調(diào)AQP-4 組大鼠腦子細(xì)胞排列較為規(guī)則,細(xì)胞核破裂情況、水腫、炎癥入侵情況較輕。

圖1 各組大鼠腦組織病理HE 染色圖Figure 1 HE staining of the pathological brain tissue of rats in each group

2.3 各組大鼠神經(jīng)功能和腦組織含水量對(duì)比

如表2 所示,與正常組相比,模型組、上調(diào)AQP-4 組、下調(diào)AQP-4 組神經(jīng)功能評(píng)分上升,腦組織含水量增多(P<0.05);與模型組和上調(diào)AQP-4 組相比,下調(diào)AQP-4 組神經(jīng)功能評(píng)分下降,腦組織含水量減少(P<0.05)。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量對(duì)比( x-±s,n=10)Table 2 Comparison of nerve function score and brain tissue water content of rats in each group

2.4 各組大鼠TNF-α、IL-1β 水平比較

如表3 所示,與正常組比較,其他三組大鼠TNF-α、IL-1β 水平升高(P<0.05);與模型組和上調(diào)AQP-4 組相比,下調(diào)AQP-4 組大鼠TNF-α、IL-1β 水平下降(P<0.05)。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-1β 水平比較( x-±s,n=10)Table 3 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in each group

2.5 各組大鼠AQP-4、BMP4、P-Smad 表達(dá)比較

如表4、圖2 所示,與正常組比較,其他三組大鼠AQP-4 表達(dá)上升、BMP4、P-Smad 表達(dá)下降(P<0.05);與模型組和上調(diào)AQP-4 組相比,下調(diào)AQP-4組大鼠AQP-4 表達(dá)下降、BMP4、P-Smad 表達(dá)上升(P<0.05)。

圖2 AQP-4、BMP4、P-Smad 表達(dá)Western blot 蛋白圖Note. A, Normal group. B, Model group. C, Upregulated AQP-4 group. D, Downregulated AQP-4 group.Figure 2 Western blot protein expression ofAQP-4, BMP4 and P-Smad

表4 各組大鼠AQP-4、BMP4、P-Smad 表達(dá)比較(±s,n=10)Table 4 Comparison of expressions of AQP-4, BMP4 and P-Smad in each group

表4 各組大鼠AQP-4、BMP4、P-Smad 表達(dá)比較(±s,n=10)Table 4 Comparison of expressions of AQP-4, BMP4 and P-Smad in each group

注:與正常組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與上調(diào)AQP-4組相比,cP<0.05。Note.Compared with normal group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with the upregulated AQP-4 group,cP<0.05.

組別Groups AQP-4 BMP4 P-Smad正常組Normal group 0.35±0.05 1.58±0.79 1.53±0.69模型組Model group 1.03±0.12a 0.75±0.12a 0.57±0.10a上調(diào)AQP-4 組Upregulated AQP-4 group 1.24±0.15ab 0.61±0.09ab 0.49±0.09ab下調(diào)AQP-4 組Downregulated AQP-4 group 0.59±0.09abc 1.32±0.56abc 1.00±0.54abc F 15.235 13.582 13.215 P<0.001 <0.001 <0.001

2.6 各組大鼠Na+、P-dp 含量比較

如表5 所示,與正常組比較,其他三組大鼠Na+、P-dp 含量上升(P<0.05);與模型組和上調(diào)AQP-4 組相比,下調(diào)AQP-4 組大鼠Na+、P-dp 含量下降(P<0.05)。

表5 各組大鼠Na+、P-dp 含量比較(±s,,n=10)Table 5 Comparison of Na+ and P-dp contents in each group

表5 各組大鼠Na+、P-dp 含量比較(±s,,n=10)Table 5 Comparison of Na+ and P-dp contents in each group

注:與正常組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與上調(diào)AQP-4組相比,cP<0.05。Note. Compared with normal group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with the upregulated AQP-4 group, cP<0.05

組別Groups Na+(mg/g) P-dp(U/g)正常組Normal group 0.25±0.05 7.51±2.23模型組Model group 1.02±0.12a 12.52±3.59a上調(diào)AQP-4 組Upregulated AQP-4 group 1.13±0.15ab 13.54±3.79ab下調(diào)AQP-4 組ownregulated AQP-4 group 0.41±0.09abc 8.21±2.21abc F 14.859 20.135 P<0.001 <0.001 D

3 討論

腦出血是目前人類死亡率較高的疾病之一,但該病的發(fā)病嚴(yán)重機(jī)制尚未明確[5]。 當(dāng)腦缺血-再灌注發(fā)生時(shí),不僅會(huì)造成腦水腫,還會(huì)對(duì)機(jī)體神經(jīng)功能造成嚴(yán)重的損傷[6]。 截止到目前,臨床眾多學(xué)者仍并未將腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制研究透徹,所以臨床的治療不太理想。 有學(xué)者指出,AQP-4 的分布于腦內(nèi)水分子的運(yùn)轉(zhuǎn)有一定的關(guān)聯(lián),其對(duì)于維護(hù)大腦中的水平衡起到了一定的作用。 腦缺血再灌注損傷中AQP-4 呈現(xiàn)異常的表達(dá)[7]。 但是目前關(guān)于調(diào)控AQP-4 表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注損傷干預(yù)效果的研究還鮮有報(bào)道。

AQP-4 作為一種水通道蛋白,廣泛的存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,其能夠構(gòu)成膠質(zhì)細(xì)胞和腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[8]。 臨床研究顯示,AQP-4 的表達(dá)與腦脊液的分泌、重吸收、電解質(zhì)等生理過(guò)程密切相關(guān)[9]。 大量學(xué)者在研究中提到,水通道蛋白是一類存在于所有生命細(xì)胞屏障中膜轉(zhuǎn)移通道的蛋白質(zhì),它們能夠容許水分子在細(xì)胞和它的周圍環(huán)境間運(yùn)動(dòng),其主要分布在腦組織內(nèi)面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜等細(xì)胞膜的足突上[10-11]。 本文研究中顯示,腦缺血再灌注損傷大鼠AQP-4 表達(dá)異常升高,對(duì)其進(jìn)行下調(diào)能夠?qū)Υ竽X提供保護(hù)作用,改善腦缺血再灌注損傷大鼠認(rèn)知功能、神經(jīng)功能,使學(xué)習(xí)記憶能力得到提升,由此可見,對(duì)大鼠AQP-4 表達(dá)進(jìn)行下調(diào)對(duì)大腦有著較好的保護(hù)作用。

大量臨床研究顯示,腦缺血再灌注損傷與炎癥因子有著一定的關(guān)聯(lián),TNF-α、IL-1β 是臨床最常用的檢測(cè)因子,對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)^為直觀的觀測(cè)出腦缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展[12]。 有臨床研究顯示,腦缺血再灌注損傷時(shí)炎癥因子異常表達(dá),對(duì)其進(jìn)行有效的干預(yù)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行調(diào)控,說(shuō)明炎癥因子和腦缺血再灌注損傷有著密切的關(guān)聯(lián)[13]。 本文研究中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷大鼠TNF-α、IL-1β水平較高,說(shuō)明腦缺血再灌注損傷常常伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生,與上述表達(dá)一致。 本文研究中還發(fā)現(xiàn),下調(diào)AQP-4 表達(dá)的腦缺血再灌注損傷大鼠TNFα、IL-1β 水平下降,說(shuō)明下調(diào)AQP-4 表達(dá)能夠減輕腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的炎癥反應(yīng)程度,進(jìn)而達(dá)到保護(hù)腦組織的作用。

大量研究表明,BMP4/Smad 通路在細(xì)胞凋亡、分化等過(guò)程中均有所參與,BMP4、Smad 為BMP4/Smad 通路的最主要配體[14]。 目前臨床對(duì)BMP4/Smad 通路和AQP-4 表達(dá)的相關(guān)性尚未有報(bào)道。 本文研究中發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注損傷大鼠BMP4、Smad表達(dá)較低,下調(diào)AQP-4 表達(dá)的腦缺血再灌注損傷大鼠BMP4、Smad 表達(dá)上調(diào),說(shuō)明腦缺血再灌注損傷伴隨著腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡,對(duì)AQP-4 表達(dá)進(jìn)行下調(diào),能夠通過(guò)BMP4/Smad 通路抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組組織的自噬和凋亡,對(duì)腦組織進(jìn)行保護(hù)。

綜上所述,對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠進(jìn)行下調(diào)AQP-4 表達(dá),能夠改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)功能,減輕腦缺血在灌注損傷大鼠的炎癥反應(yīng),出現(xiàn)上述情況的原因可能與調(diào)控BMP4/Smad通路有關(guān),為腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供了新的研究方向和理論依據(jù)。