張躍其,胡炳蕾,王默然,馬海強(qiáng),張 君,陳學(xué)叢?

(1.濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 濰坊 261000;2.濰坊市中醫(yī)院婦科,山東 濰坊 261000;3.濰坊市中醫(yī)院老年科,山東 濰坊 261000;4.濰坊市中醫(yī)院骨科,山東 濰坊 261000;5.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,濟(jì)南 250013)

帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)是一種神經(jīng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為靜息性震顫、姿勢(shì)異常、肢體僵硬和運(yùn)動(dòng)障礙,60 歲以上的人群中患病率約為1%[1],而未來(lái)20 年罹患人數(shù)將增加一倍,全世界PD 患者預(yù)計(jì)將超過1400 萬(wàn)[2],因此,針對(duì)PD 治療措施的研究具有重要的社會(huì)及臨床意義。PD 的神經(jīng)化學(xué)特征包括活性氧生成、線粒體功能障礙、炎癥、錯(cuò)折疊蛋白的積累和泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能障礙。 目前研究發(fā)現(xiàn)自噬途徑調(diào)控異常在PD 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[3],其參與了PD 患者中多種病理過程,最終出現(xiàn)清除受損蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞器功能異常。

芹菜素(4’、5、7-三羥基黃酮,apigenin, AGN)是存在于水果和蔬菜(例如洋蔥,橙子)中的類黃酮的一個(gè)子類[4],而類黃酮可以保持黑質(zhì)紋狀體的完整性和功能性[5]。 AGN 在各種細(xì)胞類型中具有多種生物活性,例如抗氧化、抗炎和抗腫瘤發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)AGN 可保護(hù)腦神經(jīng)血管抵抗淀粉樣蛋白-β25-35誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)毒性[6],此外AGN 可預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥毒性,并維持適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元相互作用[7]。 AGN 可以作為潛在的神經(jīng)保護(hù)劑來(lái)對(duì)抗與PD 相關(guān)的病理過程[4]。 自噬是細(xì)胞降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的生理過程,其與PD 的發(fā)展密切相關(guān)[8],目前尚未有關(guān)于AGN 對(duì)PD 細(xì)胞模型中的神經(jīng)保護(hù)作用及自噬影響的報(bào)道。 因此,在本研究中,我們研究了AGN 對(duì)MPP+誘發(fā)的PD 模型中細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激的影響及神經(jīng)保護(hù)作用,為新的PD 臨床治療措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC(ATCC-CRL-2260TM)公司。

1.2 主要試劑與儀器

芹菜素購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司(純度98%,12806KH);胎牛血清(FBS)以及DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;鏈霉素及青霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自法國(guó)Transgene 公司;Capase-3 兔單克隆抗體、Bcl-2 兔單克隆抗體及Beclin 兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;LC3-II兔單克隆抗體、Bax 兔單克隆抗體、ULK1 兔單克隆抗體、β 單克隆抗體-鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;二抗及ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore;蛋白電泳系統(tǒng)購(gòu)自北京六一儀器廠;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad;激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD(FACSAria III)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中。 細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育條件為37℃、5% CO2。 細(xì)胞密度90%時(shí)胰酶消化傳代,按照每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8 篩選AGN 有效濃度

以CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力。 向每孔加入CCK-8 溶液20 μL,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度,計(jì)算細(xì)胞活性。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 本部分實(shí)驗(yàn)分6 組:①對(duì)照組:DMEM 培養(yǎng)基;②MPP+組:DMSO(濃度0.5%)+2.5 mmol/L 的MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞24 h;③A 組:加入AGN 孵育細(xì)胞2 h 后再加入MPP+,AGN 終濃度10 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;④B 組:AGN 終濃度20 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;⑤C 組:AGN 終濃度40 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;⑥D(zhuǎn) 組:AGN 終濃度100 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

確定AGN 有效濃度后,將細(xì)胞分為3 組:對(duì)照組、MPP+組及芹菜素有效劑量組。 采用AnnexinV與PI 共染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 將細(xì)胞培養(yǎng)于96 孔板,每孔加入Annexin V-FITC 結(jié)合液,輕輕重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻,室溫(25℃)避光孵育20 min,隨后置于冰浴中,用流式細(xì)胞儀FITC 和PI 通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

收集細(xì)胞經(jīng)勻漿后,經(jīng)RIPA 法裂解提取蛋白。超聲裂解儀裂解10 次后低溫離心機(jī)中離心30 min,取上清并用BCA 法定量蛋白濃度,蛋白經(jīng)SDSPAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,脫脂牛奶搖床上封閉1 h,加入一抗后置4℃恒溫?fù)u床過夜。 洗膜3 次后室溫孵育二抗1 h,利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶,采用Image-J 軟件分析定量蛋白條帶,β-actin為內(nèi)參。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 氧化應(yīng)激檢測(cè)

分別收集3 組細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后超聲波破碎細(xì)胞,4℃離心10 min 后取上清,采用丙二醇(malonaldehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測(cè)試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)檢測(cè)試劑盒用來(lái)檢測(cè)各組中氧化應(yīng)激相關(guān)底物的改變,分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度,具體方法參照試劑盒說明書。 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.6 GFP-LC3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將SH-SY5Y 細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)接種6 孔板,每孔轉(zhuǎn)染2 μg GFP-LC3 質(zhì)粒,孵育6 h 更換新培養(yǎng)基,加入相應(yīng)的藥物處理24 h 后進(jìn)行GFP-LC3斑點(diǎn)計(jì)數(shù)分析。 在胞漿及胞核中GFP-LC3 散在分布的細(xì)胞為自噬陰性細(xì)胞,出現(xiàn)GFP-LC3 斑點(diǎn)聚集的為自噬陽(yáng)性細(xì)胞,各組計(jì)數(shù)至少100 個(gè)自噬陽(yáng)性細(xì)胞中的GFP-LC3 斑點(diǎn)。 于激光共聚焦顯微鏡下掃描轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多樣本均數(shù)的比較采用ANOVA 分析檢驗(yàn),事后各組間的兩兩比較采用Tukey 法,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AGN 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)首先通過CCK-8 法對(duì)AGN 的有效保護(hù)濃度進(jìn)行篩選。如圖1所示, 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L 三種濃度的AGN 能顯著降低MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷,細(xì)胞活性明顯改善(相較MPP+組,P值分別<0.05、<0.01、<0.01)。AGN 濃度在40 μmol/L 時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng),選擇40 μmol/L 作為最佳藥物保護(hù)濃度進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 不同劑量AGN 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響Note. Compared with the MPP+ group, ?P <0.05, ??P <0.01.Figure 1 Effects of different doses of AGN on the viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.2 AGN 對(duì)MPP+誘導(dǎo)模型細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為3 組:對(duì)照組、MPP+組、AGN+MPP+組(AGN 40 μmol/L)。 如圖2A、2B 所示,MPP+組細(xì)胞凋亡率為11.03%,較對(duì)照組升高(P<0.01);AGN+MPP+組細(xì)胞凋亡率為6.12%,較MPP+組下降(P<0.05)。 隨后我們比較了各組Caspase3 及Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)。 如圖2C、2D 所示,相較于對(duì)照組,MPP+組細(xì)胞Caspase3 表達(dá)明顯升高,Bcl-2/Bax 值明顯降低(P<0.01);而AGN+MPP+組相較MPP+組,Caspase3 表達(dá)降低,Bcl-2/Bax 值明顯升高(P<0.01)。 以上結(jié)果表明AGN 可改善MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖2 AGN 對(duì)細(xì)胞模型凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響Note. A, Apoptotic rate of each group was detected by flow cytometry. B, Comparison of cell apoptosis rate in each group,Compared with control group,??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05. C, Western blot was used to detect the expression of Caspase3, Bcl-2 and Bax protein in each group. D, Comparison of the relative level of Caspase3 and Bcl-2/Bax value in each group. Compared with Control group,??P<0.01. Compared with MPP+ group, ##P<0.01.Figure 2 Effect of AGN on cell apoptosis and apoptosis-related proteins

2.3 AGN 對(duì)MPP+誘導(dǎo)模型細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

進(jìn)一步檢測(cè)各組中氧化應(yīng)激相關(guān)底物表達(dá)及酶活性。 和對(duì)照組相比,MPP+促進(jìn)了MDA 表達(dá)(P<0.01),而與MPP+組比較AGN 可抑制MDA 的表達(dá)(P<0.05)。 和對(duì)照組相比,MPP+組細(xì)胞GPX和SOD 活性降低,而與MPP+組比較AGN 能恢復(fù)GPX 和SOD 的活性(P<0.05)。 見圖3。

圖3 AGN 對(duì)模型細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Note. Compared with Control group, ?P<0.05, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.01.Figure 3 Effect of AGN on oxidative stress of model cells

2.4 AGN 對(duì)MPP+誘導(dǎo)模型細(xì)胞GFP-LC3 斑點(diǎn)形成及自噬蛋白的影響

為進(jìn)一步明確AGN 對(duì)MPP+誘導(dǎo)模型細(xì)胞自噬的影響,我們進(jìn)行了GFP-LC3 斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)。GFP-LC3 斑點(diǎn)作為胞漿內(nèi)的自噬標(biāo)志物,可以反映出自噬體對(duì)LC3 蛋白的募集情況。 將GFP-LC3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞,結(jié)果顯示MPP+組細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3 斑點(diǎn)較對(duì)照組顯著增多(P<0.01),而AGN+ MPP+組細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3 斑點(diǎn)較MPP+組顯著減少(P<0.05)。 見圖4A、4B。 隨后我們觀察了LC3、Beclin-1 及ULK-1 蛋白的表達(dá)水平。 MPP+處理后,LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK1 表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P值均<0.01);而對(duì)比MPP+組,AGN+MPP+組LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK1表達(dá)顯著降低(P值均<0.05),見圖4C、4D。 以上結(jié)果進(jìn)一步證明了AGN 可顯著降低MPP+誘導(dǎo)模型細(xì)胞的自噬體形成及自噬水平。

圖4 AGN 對(duì)GFP-LC3 斑形成及自噬蛋白的影響Note. A, GFP-LC3 spots in each group observed by the confocal laser microscope. B, Comparison of GFP-LC3 spots in each group.Compared with control group, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05. C, Western blot was used to detect the expression of LC3, Beclin-1 and ULK1 proteins in each group. D, Comparison of the LC3-II/LC3-I ratio and the expression of Beclin-1, ULK1 in each group. Compared with Control group, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05.Figure 4 Effect of AGN on GFP-LC3 plaque formation and autophagy protein

3 討論

PD 病理特征是黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元逐漸喪失,隨后紋狀體中多巴胺水平下降,當(dāng)神經(jīng)元減少50%~70%時(shí)會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀[9]。 目前研究證實(shí)氧化應(yīng)激是PD 致病機(jī)制的重要因素,導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)失調(diào),進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元減少[10]。在本研究我們發(fā)現(xiàn)AGN 能減輕MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y 細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)抗氧化能力,并能降低細(xì)胞自噬水平,提示AGN 對(duì)帕金森模型細(xì)胞的保護(hù)作用與降低細(xì)胞自噬水平相關(guān)。

氧化應(yīng)激在PD 中的神經(jīng)變性改變起著關(guān)鍵作用,可促炎性細(xì)胞因子、活性氧(ROS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)以及超氧化物的釋放而加速神經(jīng)退行性過程,加劇了多巴胺能神經(jīng)元的損傷[10-11]。PD 患者紋狀體和黑質(zhì)致密部的尸檢表明,氧化應(yīng)激會(huì)損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 功能,同時(shí)降低SOD、過氧化氫酶和GPX 的含量[12-14]。 SOD 和GPX 是清除活性氧自由基的主要酶,其水平降低會(huì)使細(xì)胞更容易受到氧化損傷[13]。 PD 患者GPX、SOD 顯著耗竭,蛋白質(zhì)及DNA 氧化水平顯著增加[15]。 人體解剖數(shù)據(jù)表明,氧化應(yīng)激的啟動(dòng)最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[14]。 另一項(xiàng)臨床研究表明,PD 患者黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的核因子kB(NF-κB)的核易位倍數(shù)增加,并且NF-κB 由氧化應(yīng)激觸發(fā),放大了炎癥和凋亡程序的過程[16]。 因此,具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化效能的藥物具有減緩神經(jīng)變性進(jìn)程的潛力,有助于促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活,從而減輕疾病表現(xiàn)。 在各種PD 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?用抗炎藥抑制神經(jīng)炎癥可減輕多巴胺能神經(jīng)退行性變[17]。

在本研究中,AGN 作用下SOD、GPX、MDA 水平的改變證實(shí)了AGN 對(duì)PD 模型細(xì)胞具有很好抗氧化應(yīng)激作用。 AGN 是多種植物中存在的多酚類物質(zhì),已知其具有多種生理益處,尤其是在清除自由基、改善認(rèn)知障礙、改善學(xué)習(xí)和記憶方面[18]。 有研究對(duì)AGN 在轉(zhuǎn)基因帕金森果蠅模型中的治療效能進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其可改善果蠅的運(yùn)動(dòng)能力[19]。 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的研究證明,AGN 對(duì)炎性介質(zhì)具有抑制作用,表明其在神經(jīng)退行性疾病中可能具有神經(jīng)保護(hù)作用[18]。 另一項(xiàng)研究表明AGN 能促進(jìn)成年小鼠的神經(jīng)發(fā)生,提示其具備神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)能力[20]。

自噬是一種降解和回收細(xì)胞組分的溶酶體依賴性的內(nèi)源性過程,目前已經(jīng)證實(shí)其與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。 在本研究中,AGN 在帕金森模型細(xì)胞中可抑制LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK-1,并抑制LC3 斑點(diǎn)形成,減輕自噬水平。 MPP+是線粒體呼吸鏈復(fù)合體的抑制劑,MPP+可模擬PD 病理過程,其誘導(dǎo)的氧化損傷類似于PD 患者大腦中發(fā)現(xiàn)的氧化損傷,損害細(xì)胞線粒體功能,而這會(huì)觸發(fā)細(xì)胞自噬水平[21]。 此外,在PD 患者中線粒體膜上a-Syn 過度積累可導(dǎo)致心磷脂暴露于線粒體外膜,從而募集LC3 連接蛋白,誘導(dǎo)線粒體自噬[22]。Zhu 等[23]在2012 年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),加入ERK 信號(hào)通路特異性抑制劑可抑制MPP+導(dǎo)致的自噬水平升高。 以UO126 抑制MPP+所致的自噬水平升高,會(huì)出現(xiàn)線粒體膜電位水平升高,線粒體活性氧水平降低[24]。 半胱氨酰白三烯受體拮抗劑可同步抑制花生四烯酸相關(guān)的炎性應(yīng)激及自噬水平,從而保護(hù)神經(jīng)元,發(fā)揮對(duì)全腦缺血的治療作用[25]。 與上述研究類似,本研究中MPP+可增強(qiáng)自噬及氧化應(yīng)激水平,而AGN 可抑制自噬及氧化應(yīng)激水平。 UNC51樣激酶(ULK1)是啟動(dòng)自噬級(jí)聯(lián)反應(yīng)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。 研究發(fā)現(xiàn),miR-132-5p 可靶向抑制ULK1,改善細(xì)胞活力并減少M(fèi)PTP 誘導(dǎo)的SHSY5Y 細(xì)胞凋亡[26],百可利能抑制ULK1 蛋白過度活化,減輕自噬水平,使帕金森模型小鼠紋狀體中酪氨酸羥化酶表達(dá)上調(diào),改善小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙[27]。另一項(xiàng)研究表明,在MPP+處理的MN9D 細(xì)胞中ULK1 表達(dá)增加,而敲低ULK1 則增加了神經(jīng)元細(xì)胞的活力[28]。 本研究中AGN 抑制了MPP+誘導(dǎo)的ULK1 表達(dá)增高,結(jié)合前述研究結(jié)果分析,AGN 可能是通過調(diào)控自噬通路影響了線粒體的氧化應(yīng)激,進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上,我們的結(jié)果表明,AGN 能緩解MPP+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,減輕細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞自噬水平。本研究揭示了AGN 可能通過影響自噬來(lái)降低氧化應(yīng)激水平,從而減弱了MPP+介導(dǎo)的毒性,發(fā)生細(xì)胞保護(hù)作用。 但由于氧化應(yīng)激的復(fù)雜性及自噬調(diào)控的多樣性,AGN 調(diào)控自噬及氧化應(yīng)激的具體分子機(jī)制仍需我們進(jìn)一步研究,為PD 的轉(zhuǎn)化治療應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。