張 芮司 維*

(1.昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,昆明 650500;2.省部共建非人靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的以高血糖為特征的一組慢性代謝疾病,主要分為1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)、 2 型 糖 尿 病 (Type 2 diabetes mellitus, T2DM)、妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)和單基因糖尿病[1]。 根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(http:/ /www.diabetesatlas.org/)的統(tǒng)計(jì),截至2019 年全球糖尿病患者超4.63 億,預(yù)計(jì)2045 年將增至7 億。 中國(guó)已成為糖尿病第一大國(guó),患者超過1.16 億。 其中,T1DM 是一種由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。 由于胰島β 細(xì)胞受損而導(dǎo)致胰島素分泌不足[1],T1DM 患者需要完全依賴外源胰島素治療。 雖然胰島素治療已從過去的“每日餐前一針”發(fā)展到“人工智能控制的胰島泵”[2],但并不能根治,也不能防止包括視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變等一系列并發(fā)癥的發(fā)生[3]。 近年來(lái),胰島移植結(jié)合免疫抑制已成功應(yīng)用于T1DM 的治療[4],但由于供體器官嚴(yán)重缺乏、需要終身免疫抑制以及胰島移植后難以長(zhǎng)期存活等問題限制了臨床應(yīng)用[5]。 因此,干細(xì)胞替代療法有望成為治療T1DM 的醫(yī)學(xué)發(fā)展新途徑[6],就應(yīng)用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生功能性胰島β 細(xì)胞或胰島類器官替代治療T1DM 的研究進(jìn)展作一綜述,為干細(xì)胞治療T1DM的臨床轉(zhuǎn)化提供參考和借鑒。

1 體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞

胰島β 細(xì)胞的再生和替代治療被認(rèn)為是治愈T1DM 的有效途徑,目前研究多為基于動(dòng)物模型的臨床前研究,主要以人胚胎干細(xì)胞(human embryo stem cells,hESCs)、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells,ASCs)等為種子細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,并通過細(xì)胞移植修復(fù)或替代受損胰腺組織[7]。

1.1 胚胎干細(xì)胞的替代療法

自2001 年首次發(fā)現(xiàn)hESCs 能在體外自發(fā)分化為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞以來(lái)[8],許多分化方案被陸續(xù)報(bào)道,產(chǎn)生了多激素細(xì)胞的混合群體,但整體分化效率低下且胰島素含量低。 2006 年 D’Amour 等[9]模擬胰腺發(fā)育,使用五步誘導(dǎo)法分化出含有7%胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的內(nèi)分泌細(xì)胞團(tuán),但缺乏對(duì)葡萄糖刺激產(chǎn)生反應(yīng)的功能。 Kroon 等[10]誘導(dǎo)hESCs 定向分化為胰腺祖細(xì)胞,移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)一步成熟為功能性的胰島β 樣細(xì)胞,并可以維持3 個(gè)月的體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。 2014 年Rezania 等[11]取得重大突破,采用七步誘導(dǎo)法從hESCs 中分化出表達(dá)胰島β 細(xì)胞關(guān)鍵標(biāo)志物包括MAFA和INS等的胰島β 樣細(xì)胞,移植后2~6 周就能成功逆轉(zhuǎn)DM 小鼠血糖。此外,Pagliuca 等[12]開發(fā)了懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)能大規(guī)模生產(chǎn) hESCs 衍生的胰島 β 細(xì)胞(SC-β 細(xì)胞)。 鑒別分化過程中形成的細(xì)胞類型對(duì)提高β 細(xì)胞的分化比例尤為重要,最近一項(xiàng)研究利用單細(xì)胞RNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)hESCs 誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的細(xì)胞類型進(jìn)行了分析,鑒定出了胰島β 細(xì)胞、α 樣多激素細(xì)胞、非內(nèi)分泌細(xì)胞和未曾報(bào)道過的腸嗜鉻細(xì)胞,而且用攜帶CD49a 抗體的微珠磁性分選成功富集到80%以上的SC-β 細(xì)胞[13-14],為進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

目前,所有hESCs 誘導(dǎo)分化胰島β 細(xì)胞的方案都依賴于對(duì)生長(zhǎng)因子以及分子信號(hào)通路激活或抑制的調(diào)控,例如最近提出的優(yōu)化方案:抑制YAP 促進(jìn)胰島β 細(xì)胞生成,改善胰島素分泌功能[15];抑制WNT 通路提高分化效率,增加內(nèi)分泌細(xì)胞的比例[16]等。 盡管利用 hESCs 分化生產(chǎn)胰島 β 細(xì)胞已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展,但仍存在如hESCs 的倫理限制以及異體細(xì)胞排斥反應(yīng)等障礙,而且不同的hESCs細(xì)胞系分化能力也存在差異,限制了其臨床應(yīng)用[17]。

1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的替代療法

利用患者自體細(xì)胞通過重編程獲得hiPSCs,定向誘導(dǎo)分化獲得遺傳背景一致的胰島β 細(xì)胞,在治療 T1DM 方面有巨大潛力[18]。 2008 年 Tateishi等[19]首先證明了皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的hiPSCs 能夠通過模擬胰腺發(fā)育在體外產(chǎn)生胰島樣簇,隨后Zhang 等[20]誘導(dǎo)分化的胰島素生成細(xì)胞能檢測(cè)到PDX1 的表達(dá)和C 肽的合成。 針對(duì)hESCs 開發(fā)的胰島β 細(xì)胞分化方案已成功應(yīng)用于hiPSCs[11]。 值得注意的是,胰腺祖細(xì)胞中PDX1 和NKX6.1 的共表達(dá)對(duì)于有效生成功能性胰島β 細(xì)胞是必不可少的,Russ 等[21]去除了常用的BMP 抑制劑,使用維甲酸聯(lián)合EGF/KGF,有效地誘導(dǎo)出PDX1+/NKX6.1+胰腺祖細(xì)胞群,產(chǎn)生對(duì)葡萄糖刺激有反應(yīng)的胰島β 樣細(xì)胞,降低 DM 小鼠血糖,在短期移植后仍保持功能。

hiPSCs 來(lái)源的胰島β 細(xì)胞結(jié)合基因編輯技術(shù)是細(xì)胞療法的一個(gè)主要方向。 Maxwell 等[22]利用Wolfram 綜合征患者的hiPSCs 誘導(dǎo)分化為胰島β 細(xì)胞,使用CRISPR-Cas9 技術(shù)糾正細(xì)胞WFS1 基因的突變后移植到 DM 小鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)了血糖,這是CRISPR 首次被用于修復(fù)DM 患者的遺傳缺陷,開啟了基因編輯結(jié)合細(xì)胞治療DM 的新篇章。 CRISPR基因誘導(dǎo)系統(tǒng)(CRISPR-on)是一種新型的RNA 引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng),Giménez 等[23]用融合了轉(zhuǎn)錄激活因子(dCas9-VP160)的 CRISPR-ON 系統(tǒng)轉(zhuǎn)染T1DM 患者的成纖維細(xì)胞,激活胰島β 細(xì)胞發(fā)育基因如內(nèi)源性人胰島素基因(INS),增強(qiáng)了胰島素分泌。 但目前患者來(lái)源的hiPSCs 分化效率較低[24],還存在腫瘤轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)、基因組不穩(wěn)定及成本高等諸多不利因素。

1.3 成體干細(xì)胞的替代療法

ASCs 是存在于成年后各組織器官中具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞。 可從T1DM 患者中分離出成體干細(xì)胞,在體外定向誘導(dǎo)分化為胰島β 細(xì)胞,再移植回患者體內(nèi)達(dá)到長(zhǎng)期治療的目的。 具有強(qiáng)大免疫調(diào)節(jié)特性、多向分化潛能、自我更新能力的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在臨床試驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用[25]。 MSCs 調(diào)控促炎癥作用的效應(yīng)T 細(xì)胞,抑制自身免疫反應(yīng),單獨(dú)或與胰島β 細(xì)胞聯(lián)合移植可有效逆轉(zhuǎn)T1DM 患者的高血糖狀況[26],使T1DM 患者體內(nèi)剩余的胰島β 細(xì)胞功能得以部分恢復(fù)或延遲細(xì)胞損傷[27]。 近年來(lái),許多研究團(tuán)隊(duì)把不同來(lái)源的人MSC 誘導(dǎo)分化為胰島β 細(xì)胞,在DM 小鼠體內(nèi)可分泌胰島素,表現(xiàn)出與人胰島β 細(xì)胞相似的Ca2+變化和L 型Ca2+通道活性[28]。 另一方面,將胰腺關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如PDX-1等基于病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MSC 也能獲得具有胰島β 細(xì)胞功能的細(xì)胞[29]。

脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissuederived MSCs,ADMSCs)因其來(lái)源豐富且易于分離成為目前研究的焦點(diǎn)之一。 使用 ADMSCs 治療T1DM 的方法大致可以分為以下四類:(1)ADMSCs誘導(dǎo)分化胰島素分泌細(xì)胞(Insulin-producing cells,IPCs) 用于移植治療 T1DM[30],在分化過程中ADMSCs 的免疫調(diào)節(jié)特性能得到維持[31],與未分化的ADMSCs 相比,IPCs 可以耐受移植物排斥反應(yīng)。(2)單獨(dú)移植ADMSCs 治療T1DM 能改善胰島功能,增加血清胰島素水平[32],其治療有效性在T1DM 動(dòng)物模型中已得到認(rèn)可,但單獨(dú)使用ADMSCs治療還局限于T1DM 患者發(fā)病早期[33]。 (3)許多研究小組闡明使用ADMSCs 聯(lián)合胰島移植的有效性和多功能性,發(fā)現(xiàn)ADMSCs 聯(lián)合移植治療可以逆轉(zhuǎn)T1DM 小鼠血糖,明顯抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),促進(jìn)移植物血管生成,延長(zhǎng)存活時(shí)間[34]。 (4)ADMSCs 還被用于培養(yǎng)胰島,在移植前將ADMSCs 與胰島共培養(yǎng)有助于提高胰島的生存能力,增加胰島素釋放,能顯著改善DM 小鼠的高血糖癥狀[35]。

此外,Wang 等[36]對(duì)成年小鼠胰島進(jìn)行單細(xì)胞RNA 測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了特異表達(dá)蛋白C 受體 (Procr)的胰島成體干細(xì)胞,在體內(nèi)正常生理狀態(tài)下可分化形成四種類型的內(nèi)分泌細(xì)胞,進(jìn)一步培養(yǎng)可形成穩(wěn)定的胰島類器官,該研究回答了長(zhǎng)期以來(lái)成體胰島是否存在干細(xì)胞這一爭(zhēng)議性問題,是干細(xì)胞基礎(chǔ)研究的重大突破。 未來(lái),胰島成體干細(xì)胞將有望應(yīng)用于T1DM 的治療。

ASCs 獲取相對(duì)容易,不存在倫理問題,同種異體免疫排斥反應(yīng)與致瘤風(fēng)險(xiǎn)低,目前研究多集中在測(cè)試其恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)以及再生胰島β 細(xì)胞的潛力。

2 干細(xì)胞衍生的胰島類器官

天然胰島是由 α,β,δ,ε 和 PP 細(xì)胞形成的異質(zhì)結(jié)構(gòu),這種3D 構(gòu)象產(chǎn)生的細(xì)胞間相互作用在調(diào)節(jié)激素分泌方面發(fā)揮著重要作用[37]。 胰島類器官(pancreatic organoids,POs)是由原代胰腺組織或干細(xì)胞形成的與體內(nèi)胰島功能和組織類似的三維結(jié)構(gòu),是研究生理及病理?xiàng)l件下胰島細(xì)胞的增殖分化及其與微環(huán)境的相互作用的理想方法。 大量研究表明,干細(xì)胞可以產(chǎn)生功能性POs,當(dāng)植入不同的臨床前DM 動(dòng)物模型時(shí),能夠恢復(fù)至正常血糖。 2016年Kim 等[38]從 hESCs 衍生的hPOs 在體內(nèi)和體外均顯示出葡萄糖反應(yīng);隨后,Wang 等[39]基于仿生3D 支架生成的hPOs 表達(dá)高水平的胰島β 細(xì)胞標(biāo)志物如PDX-1、Ngn3、Insulin等,更重要的是,這些hPOs 類似于成人胰島,含有多種胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞,對(duì)葡萄糖刺激更敏感,高糖條件下胰島素的分泌急劇增加,這是胰島β 細(xì)胞成熟的標(biāo)志之一。 此外,一個(gè)重大突破是hPOs 植入DM 小鼠體內(nèi)后,3 d內(nèi)迅速恢復(fù)血糖;相比之下,在之前的研究中,僅移植干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的胰島β 細(xì)胞至少需要超過40 天才能使DM 小鼠的血糖水平恢復(fù)正常[10-12,21]。 研究表明,干細(xì)胞衍生的hPOs 在細(xì)胞組成和胰島微結(jié)構(gòu)等方面都更接近天然胰島[40]。

hPOs 移植體內(nèi)后面臨著氧合和宿主免疫反應(yīng)的激活導(dǎo)致hPOs 功能逐漸喪失的難題。 近年來(lái)的研究通過生物材料包封提供免疫分離生物相容性,優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)擴(kuò)散和胰島素釋放,使植入的hPOs 實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期生存并發(fā)揮功能[41]。 海藻酸鹽微膠囊能提供更好的細(xì)胞氧合促進(jìn)hESCs 分化聚集為hPOs[40]。Vegas 等[42]使用經(jīng)三唑硫代喹啉二氧化物(TMTD)修飾的藻酸鹽包封SC-β 細(xì)胞,在沒有任何免疫抑制的情況下可為T1DM 小鼠提供長(zhǎng)達(dá)174 d 的血糖校正。 TMTD 藻酸鹽在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中也開展了實(shí)驗(yàn),顯著地降低異物反應(yīng)[43]。 最近,海藻酸鈉與免疫調(diào)節(jié)趨化因子CXCL12 共包被SC-β 細(xì)胞,移植到T1DM 小鼠中促進(jìn)了胰島素分泌并實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的免疫保護(hù),有效地延長(zhǎng) SC-β 細(xì)胞的生存時(shí)間和功能[44]。 這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步開展T1DM 大動(dòng)物模型治療的臨床前研究和臨床轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

另外,為了移植物能長(zhǎng)期存活,可以通過形成新的血管獲得宿主的營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)支持。 Wang 等[36]建立了Procr+胰島干細(xì)胞與血管細(xì)胞共培養(yǎng)的3 D體系,成功獲得與小鼠胰島功能、形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄組都相似的POs,在體外培養(yǎng)能傳20 代以上,移植到DM 小鼠體內(nèi)能夠恢復(fù)血糖水平。 內(nèi)皮化也是解決hPOs 移植后血供問題的一種方法。 通過與內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)移植可增強(qiáng)支架血管的形成,研究發(fā)現(xiàn)干擾間充質(zhì)調(diào)節(jié)因子(PDGF)受體或纖維連接蛋白,可以使MSCs 向具有內(nèi)皮潛能的中胚層前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化,在體內(nèi)有效誘導(dǎo)新生血管形成[45]。 目前,納米技術(shù)通過使用不同的聚合物和天然ECM 作為封裝平臺(tái)有巨大潛力,Skrzypek 等[46]開發(fā)的聚醚砜/聚乙烯吡咯烷酮(PES/PVP)平板多孔膜,無(wú)需添加水凝膠即可創(chuàng)建早期微血管網(wǎng)絡(luò)[47],有望提高h(yuǎn)POs 存活時(shí)間。

3 展望

利用干細(xì)胞分化胰島β 細(xì)胞移植治療T1DM,能有效解決器官供體胰島短缺的問題。 然而,目前還沒有一種分化方案能夠生成功能完備的胰島β細(xì)胞以自我調(diào)節(jié)葡萄糖代謝,因此需要在細(xì)胞功能、移植后的存活率、遺傳穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本等方面進(jìn)一步優(yōu)化研究。 另外,干細(xì)胞移植治療T1DM向臨床過渡要面臨的挑戰(zhàn),還包括如何保護(hù)移植物免受異種排斥,避免自身免疫的反復(fù)發(fā)生,尋找能最大程度減少細(xì)胞損失的移植方式和部位等,這些問題的解決將有效促進(jìn)干細(xì)胞來(lái)源的胰島β 細(xì)胞替代治療的發(fā)展。