夏朝水 江斌 鄧永生 陳瑋婷 曹奕鴦

摘 要：利用ISSR技術(shù)對(duì)35份福建主栽非洲菊資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。從100條ISSR引物中篩選出多態(tài)性好的15條隨機(jī)引物，分別對(duì)35份非洲菊資源基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增得到78條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶70條，多態(tài)位點(diǎn)百分比達(dá)89.7%。利用DPS軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，各品種間的遺傳相似系數(shù)介于0.2968～0.7500，當(dāng)閾值為0.4200時(shí)，可將35個(gè)非洲菊分成4類。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.4914時(shí)，第I類非洲菊又可分為4個(gè)亞類。聚類結(jié)果表明，花心顏色和重瓣類型可以作為非洲菊親緣關(guān)系分類的一種依據(jù)，同一搜集來(lái)源的品種有聚類到一起的趨勢(shì)，這與農(nóng)藝性狀的聚類結(jié)果有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：非洲菊;種質(zhì)資源;簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S 682.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）01-0009-06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.01.002

Abstract：Genetic diversity of 35 major cultivars of Gerbera jamesonii Bolus in Fujian was analyzed by ISSR technology. 15 random primers with good polymorphism were selected from 100 ISSR primers， and were amplified on the genomic DNA of 35 Gerbera jamesonii Bolus. A total of 78 clear and distinguishable bands were obtained， of which 70 were of polymorphism， and the percentage of polymorphic sites reached 89.7%. The DPS software was used for the statistical analysis， and the results showed that the genetic similarity coefficients among the varieties ranged from 0.2968 to 0.7500. When the threshold value was 0.4200， the 35 Gerbera jamesonii Bolus could be divided into four categories. When the genetic similarity coefficient was 0.4914， the Class I Gerbera jamesonii Bolus could be further divided into four subclasses. The clustering results showed that the color of flower heart and the type of double petals could be used as a basis for the classification of genetic relationship of Gerbera jamesonii Bolus， and the varieties from the same source tended to cluster together， which had a certain corresponding relationship with the clustering results of agronomic traits.

Key words：Gerbera jamesonii Bolus; Germplasm resources; ISSR（inter-simple sequence repeat）; Genetic diversity

非洲菊Gerbera jamesonii Bolus，又名扶郎花、太陽(yáng)花，為菊科大丁草屬多年生宿根草本花卉，是世界五大鮮切花之一，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上非常暢銷，備受消費(fèi)者的青睞[1-3]。福建主栽非洲菊品種大多從外地引進(jìn)，經(jīng)常由于對(duì)品種習(xí)性不甚了解，或者品種已經(jīng)開始退化，盲目引種導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采取各種育種技術(shù)方式，及早培育出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新品種（系）非常必要。為培育超親性狀的非洲菊新品種，需分析親本資源的親緣關(guān)系才能更好地配置雜交組合，而分子標(biāo)記目前廣泛用于種質(zhì)資源親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析，因此，利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)分析非洲菊品種資源之間的親緣關(guān)系可為非洲菊遺傳改良提供更快速、可靠、穩(wěn)定的輔助選擇手段。

近年來(lái)，部分學(xué)者采用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)非洲菊進(jìn)行初步研究。李宗菊等[4]以改良的CTAB法為基礎(chǔ)，在第2次用氯仿/異戊醇抽提時(shí)，加入‘PCN溶液，可明顯去除多糖;在材料研磨時(shí)加入配制的化學(xué)物質(zhì)，可以明顯提高DNA純度及ISSRPCR擴(kuò)增質(zhì)量;利用該法所提取的DNA稀釋30倍后，進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增可得到清晰譜帶。吳莉英等[5]以非洲菊的嫩葉、老葉為材料，利用改進(jìn)的CTABFREE洗滌法提取純度、濃度都符合AFLP分析要求的DNA，獲得非洲菊清晰AFLP指紋圖譜。李達(dá)等[6]對(duì)非洲菊SRAPPCR反應(yīng)體系的影響因子進(jìn)行探討，得到了最佳的SPARPCR反應(yīng)體系。此外，張偉等[7]、張玉進(jìn)等[8]分別改進(jìn)了非洲菊不同組織總RNA的提取方法。沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)的聶京濤等[9]對(duì)75份非洲菊品種資源進(jìn)行了遺傳多樣性的ISSR分析，發(fā)現(xiàn)非洲菊具有豐富的遺傳多樣性;將非洲菊品種的花色、管狀花顏色、花徑、花型結(jié)合聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其存在一定的相關(guān)性，這為非洲菊的良種選育在分子水平上奠定了理論基礎(chǔ)。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鐘海豐等[10]設(shè)計(jì)100條ISSR引物，對(duì)外引的22個(gè)非洲菊品種進(jìn)行遺傳多樣性的ISSR分析，表明非洲菊品種間具有較豐富的遺傳多樣性，花瓣及花心顏色可以作為區(qū)分非洲菊品種分類及分析親緣關(guān)系的初步依據(jù)。因此，本研究利用ISSR分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)分析福建主栽非洲菊品種資源之間的親緣關(guān)系，為新品種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院收集的福建省內(nèi)主栽35個(gè)非洲菊品種（表1）。其中8份材料引自上海，15份材料引自清流縣鴻翔農(nóng)莊，12份材料引自福建省內(nèi)花農(nóng)與合作社。試驗(yàn)每個(gè)品種隨機(jī)選取3株采集，每株采1片嫩葉，裝于自封袋，保存于-4℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 非洲菊基因組DNA的提取采用CTAB法，方法參考《植物遺傳手冊(cè)》植物基因組總DNA提取方法[11]，試驗(yàn)所提取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度采用紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定，基因組DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選與PCR擴(kuò)增 ISSR引物的篩選是以田間植物性狀表現(xiàn)差異較大且DNA質(zhì)量較高的1號(hào)與12號(hào)材料對(duì)從上海生物工程有限公司提供的100條ISSR隨機(jī)引物中共篩選穩(wěn)定性好、條帶清晰、多態(tài)性好的引物用于非洲菊遺傳多態(tài)性試驗(yàn)[12]。

ISSRPCR反應(yīng)體系參考沈穎等[13]和聶京濤等[9]步驟稍做修改，15 μL ISSR反應(yīng)體系中包含2 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）、1 μL dNTPs、0.15 μL Taq酶（5 U·μL-1）、1 μL模板DNA（20 ng·μL-1）、1 μL引物、9.85 μLddH2O。PCR反應(yīng)在Master Cyclergradient 96梯度PCR儀（Eppendorf）上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min ，于4℃保存PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠板置于5% EB（溴化乙錠）溶液中染色后，在BIORAD公司的GelDoc 1000型凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、分析處理、保存及結(jié)果輸出。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)35份材料獲得的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每條DNA條帶記為一個(gè)單位，在相同遷移位點(diǎn)無(wú)條帶的賦值為0，有條帶的賦值為1，得到的數(shù)據(jù)用Excel錄入電腦中。數(shù)據(jù)分析采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，然后用類平均聚類法（UPGMA）對(duì)其進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR隨機(jī)引物的確定

以試驗(yàn)選出田間試驗(yàn)性狀表現(xiàn)差異較大且DNA質(zhì)量較高的1號(hào)與12號(hào)材料對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，最終確定15條多態(tài)性高、條帶清晰的引物用于分析材料的多態(tài)性。其引物名稱與序列見(jiàn)表2，用1號(hào)與12號(hào)材料篩選出的15條引物PCR擴(kuò)增帶型見(jiàn)圖1。

2.2 ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

試驗(yàn)篩選出15條多態(tài)性高的引物用于35份非洲菊材料的遺傳多樣性研究，PCR共擴(kuò)增出78條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶70條，多態(tài)位點(diǎn)百分比為89.7%，平均每條引物可擴(kuò)增4.7個(gè)多態(tài)性條帶（表3）。圖2～3為引物I34和I55對(duì)所有非洲菊品種的電泳圖譜。引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶最多的為7條，最少的為3條。15個(gè)引物中有1個(gè)是四核苷酸重復(fù)序列，2個(gè)是三核苷酸重復(fù)序列，其余12個(gè)引物都為二核苷酸重復(fù)序列，表明非洲菊基因組以二核苷酸重復(fù)居多。

2.3 聚類分析和親緣關(guān)系

采取DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用UPGMA法對(duì)其進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖（圖4），結(jié)果顯示，35份非洲菊品種資源之間的遺傳相似系數(shù)為0.2968～0.7500，其中陽(yáng)光海岸和大雪菊相似系數(shù)最大，為0.7500，表明它們之間的遺傳關(guān)系最近，其花色分別為黃色黑色與橙色黑色;紅暈和太陽(yáng)風(fēng)暴的相似系數(shù)最小，為0.2968，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，花色花心分別為白色黑心與黃色黑心。

以遺傳相似系數(shù)0.42為閾值，非洲菊35份資源可分成4類：第I類包含純黃、陽(yáng)光海岸、大紅黑心、玲瓏、熱帶草原等30份資源;第Ⅱ類有M42和大地粉2份資源，遺傳相似系數(shù)為0.4894，花色花心分別是紫色綠心和粉色綠心;第Ⅲ類只有玫瑰紫1份資源，其遺傳相似系數(shù)為0.3095，花色花心為紫色黑心。第Ⅳ類有紅暈和太陽(yáng)風(fēng)暴2份資源，遺傳相似系數(shù)為0.2968，花色花心分別為白色黑心與黃色黑心。

當(dāng)?shù)冖耦愐赃z傳相似系數(shù)0.4914為閾值時(shí)，又可分為4個(gè)亞類，第Ⅰ亞類包含純黃與綠心粉2個(gè)品種。第Ⅱ亞類包含22個(gè)品種，分2小類，第1小類包含18個(gè)品種，其中陽(yáng)光海岸和大雪菊的親緣關(guān)系最近，其遺傳相似系數(shù)為0.7500，花色花心分別為黃色黑心和橙色黑心;伊斯瑪拉的遺傳相似系數(shù)為0.5343，花色花心為粉色綠心。第2小類包含開心、紅心、法萊倫斯和香檳4個(gè)品種，其中紅心和法萊倫斯的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.6667，花色花心分別是紅色黑心和粉色綠心;香檳的遺傳相似系數(shù)最小，為0.5437，其為橙色黑心品種。第Ⅲ亞類包括熱帶草原、彩蝶、S50、紫色黑心和大香檳5個(gè)品種，其中紫色黑心和大香檳的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.7179，花色花心分別是紫色黑心和橙色黑心;熱帶草原的相似系數(shù)最小，為0.4687，其為紅色黑心品種。第Ⅳ亞類只有S29，其遺傳相似系數(shù)為0.4299，為紫色綠心品種。

3 討論

在ISSR引物的多態(tài)性篩選上，本試驗(yàn)選擇15條多態(tài)性好的引物共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶70個(gè)，平均每條引物4.7個(gè)多態(tài)性條帶，相比前人研究結(jié)果[6]，研究擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)相對(duì)較少，這可能與ISSRPCR反應(yīng)體系的組成DNA或模板量的濃度有關(guān)。試驗(yàn)由材料1號(hào)和12號(hào)篩選確定的15條多態(tài)性高、條帶清晰的ISSR引物中，有1個(gè)是四核苷酸重復(fù)序列，2個(gè)是三核苷酸重復(fù)序列，其余12個(gè)引物都為二核苷酸重復(fù)序列，表明非洲菊基因組以二核苷酸重復(fù)居多。這與繆恒彬等[14]、聶京濤等[9]的研究結(jié)果相同。

在非洲菊遺傳聚類親緣關(guān)系上，聶京濤等[9]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)非洲菊材料進(jìn)行聚類，結(jié)果表明非洲菊各品種之間的遺傳關(guān)系與其花色、花型、管狀花顏色、花徑呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。鐘海豐等[10]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)外引的22個(gè)非洲菊品種進(jìn)行遺傳多樣性及聚類分析，得出花瓣和花心顏色可作為非洲菊品種間的親緣關(guān)系分類的一種初步依據(jù)，這些研究都為非洲菊優(yōu)良品種的選育奠定了一定的分子理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)35份非洲菊品種資源聚類分析得出，品種間的遺傳相似系數(shù)為0.2968～0.7500，表明各個(gè)材料的遺傳背景和親緣關(guān)系復(fù)雜，存在較大的遺傳分化，這可能與非洲菊品種存在自交不親和性及長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖有關(guān)[15]。本研究根據(jù)ISSR聚類圖可將35份非洲菊資源分為4大類，雖然花色、花心顏色、重瓣類型等性狀沒(méi)有完全聚到一塊，但花心顏色和重瓣類型卻聚集在各個(gè)分支上，且分支上的相似度很高，說(shuō)明花心顏色和重瓣類型可以作為非洲菊親緣關(guān)系分類的一種依據(jù);特別值得注意的是，不同搜集來(lái)源的品種有聚集到一起的趨勢(shì)，其中從清流鴻翔農(nóng)莊搜集的15個(gè)品種絕大部分聚集到第Ⅱ亞類，而從農(nóng)戶或合作社收集的品種卻分散到各個(gè)類別中，這或許可能是因?yàn)檗r(nóng)戶和合作社購(gòu)買種苗的來(lái)源地不同，有云南、廣東、上海等地的種苗，這就導(dǎo)致了其親緣關(guān)系可能存在較大差別;而這些與農(nóng)藝性狀的聚類結(jié)果有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

本試驗(yàn)通過(guò)ISSR分子標(biāo)記結(jié)合農(nóng)藝性狀的聚類研究，發(fā)現(xiàn)非洲菊品種在農(nóng)藝性狀方面差異較大，且遺傳多樣性豐富，在分子水平上形成較大的遺傳變異，這可能是由于非洲菊品種間存在自交不親和性以及長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖有關(guān)。本研究通過(guò)了解非洲菊各品種的遺傳和親緣關(guān)系，為非洲菊雜交親本的選配與良種選育提供技術(shù)支持，從而加速育種進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）