周 元，傅虹飛，胡亞云

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院, 陜西 楊凌 712100)

香氣是水果果實及其相關制品品質的重要感官指標[1]。獼猴桃屬(Actinidia)果實香氣品質研究始于1982年[2]，目前已從美味(A.deliciosa)、中華(A.chinensis)、軟棗(A.arguta)、毛花(A.eriantha)等不同品種獼猴桃果實中鑒別出醇類、酯類、酸類、酮類、萜烯類等香氣物質，其中以來源于脂肪酸途徑的醛類、酸類和醇類等物質含量較高[3]。毛花獼猴桃香味比較清淡，揮發(fā)性物質組成與其他獼猴桃果實存在較大差異，推測其主要以結合態(tài)香氣前體物質形式存在[4]。而目前的相關研究多關注的是獼猴桃果實成熟過程及采后儲藏期游離態(tài)揮發(fā)性物質的變化[5-6]，對于結合態(tài)香氣前體物質的調控釋放報道較少。

果實中結合態(tài)香氣前體物質作為潛在的香氣物質來源，其含量被認為是自由態(tài)的10倍[7]。結合態(tài)香氣前體物質本身無香氣且不揮發(fā)或難揮發(fā)，為使這些潛在香氣前體分子發(fā)揮功能，就需要解開結合態(tài)糖苷鍵，從而釋放出具有揮發(fā)性的糖苷配基。糖苷配基主要包括萜烯類化合物、脂肪醇類、芳香烴類衍生物等，可在果實成熟、加工和儲藏過程中釋放出來，或者經過酶解、酸解和熱處理釋放出來[8]。β-葡萄糖苷酶則是這些香氣分子釋放過程酶系中最重要的酶之一[9]，是水解芳香物質前體、釋放結合態(tài)糖苷配基的關鍵酶[10]。國內外對β-葡萄糖苷酶用于葡萄和葡萄酒芳香物質酶解調控研究較多[11]。郭慧女等[12]比較了黑曲霉、海藻曲霉和魯氏毛霉來源的β-葡萄糖苷酶對玫瑰香葡萄結合態(tài)香氣提取物質的酶解作用效果，認為以黑曲霉來源的β-葡萄糖苷酶的酶解效果最佳。桑葦等[13]采用黑曲霉β-葡萄糖苷酶對赤霞珠葡萄新酒進行增香調控，酶解處理后香氣物質相對總量與對照相比增加24.59%，其中以4-萜品醇、α-松油醇和香葉醇等為代表的萜烯及C13-降異戊二烯類物質增加最為顯著。

我國獼猴桃種植面積和產量均居世界第一[14]，獼猴桃深加工技術的發(fā)展有益于其產業(yè)的進一步提升。β-葡萄糖苷酶是風味修飾中的關鍵酶，對果蔬制品品質提升具有十分重要的作用，但其對獼猴桃香氣的酶解釋放作用尚未見深入探討。本研究利用電子鼻(E-nose)檢測β-葡萄糖苷酶對獼猴桃汁香氣物質的釋放作用，并采用固相微萃取結合氣相色譜質譜聯(lián)用技術(SPME-GC-MS)分析酶解處理對獼猴桃汁香氣物質組成和含量的影響，旨在為獼猴桃汁酶解增香技術的研究及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃：2019年購于當地超市，品種為徐香。

化學試劑：β-葡萄糖苷酶(微生物來源)，實驗室自制；對硝基苯酚、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、檸檬酸、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、無水NaCl，均為分析純，上海國藥集團；環(huán)己酮(標品級)，上海阿拉丁公司。

1.2 儀器與設備

榨汁機(MJ-WJS1221F)，美的集團股份有限公司；手持數顯水果硬度計(GY-4)，艾普公司；電子鼻(PEN3)，德國AIRSENSE公司；氣相色譜質譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010，日本島津公司；DB-1MS 色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司；SPME萃取頭(30/50 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶酶活的確定 參考文獻[9]的方法但略有修改。將100 mg酶與5 mL的40 mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液和4 mL的1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 4.0)混合，在40 ℃下孵育30 min，添加2 mL的3 mol/L碳酸鈉溶液以終止反應，在405 nm下比色讀數，酶活用U/mg表示。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶酶解獼猴桃汁的制備 選取無機械損傷且品相良好的獼猴桃果實，測定硬度值。選擇硬度為10.0～12.0 N的果實[5]，削皮、榨汁、去渣后備用。預試驗考察了酶解溫度(25，35，45 ℃)、酶解時間(4，8，12 h)及加酶量(4，8，12 U/g)3 個因素，采用電子鼻測定酶解前后獼猴桃汁樣品的香氣成分，通過分析電子鼻傳感器響應值的變化，確定后續(xù)酶解試驗參數為：酶解溫度35 ℃，酶解時間0～8 h，加酶量為8 U/g，進一步考察酶解獼猴桃汁香氣物質的動態(tài)變化。

1.3.3 電子鼻分析條件 參考文獻[15]方法但略有修改。本研究采用的電子鼻傳感器陣列(含10個傳感器)的特征見表1。取酶解后的獼猴桃汁樣品1 g，用雙蒸水稀釋5倍，每組6個平行。設置電子鼻進氣流速為300 mL/min，每秒采集1個數據，分別記錄電子鼻10個傳感器的響應值，即G/G0值(其中G為最終電阻，G0為初始電阻)，當G/G0>2.0，可認為該傳感器對待測樣品敏感。每個樣品的電子鼻采集時間為60 s，清洗時間為300 s。

表1 電子鼻傳感器陣列的特征

1.3.4 香氣物質的SPME-GC-MS分析 (1)SPME-GC-MS條件。參考文獻[4]方法但略有修改。頂空固相微萃取條件：取5.0 g樣品放入固相微萃取瓶中，加入2.5 mL飽和氯化鈉溶液，10 μL環(huán)己酮內標(0.5 mg/mL)，45 ℃預熱2.5 min，萃取吸附45 min，GC 解析5 min，用于GC-MS 分析。GC 條件：進樣口溫度250 ℃；色譜柱初始溫度40 ℃保持2 min后，以6 ℃/min升至120℃并保持5 min，再以8 ℃/min升至200 ℃并保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃并保持8 min；載氣為高純氦氣，柱流量1.5 mL/min。MS 條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30.00～500.00 m/z。

(2)香氣物質定性與半定量方法。香氣活性成分的定性通過與NIST質譜庫中的標準譜圖進行檢索比對，并根據各物質保留指數(RI)進行確認[16]。半定量分析時，將待測物質峰面積與環(huán)己酮內標峰面積進行計算，計算公式為：

Xi=(Ai/As)×Cs。

式中：Xi為待測物質濃度；Ai為待測物質峰面積；As為內標物質峰面積；Cs為內標物質濃度。

1.4 數據分析

采用Origin 8.0軟件和Excel軟件繪圖，采用Minitab 15.0軟件進行多重比較分析(P<0.05)。采用SIMCA 14.1軟件進行雙向偏最小二乘(bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS)分析[17-19]，得到O2PLS模型中的投影用于預測變量影響(variable influence on projection for predication，VIPpred)值，其中VIPpred值>1.0的變量被認為是重要的變量。

2 結果與分析

2.1 酶解獼猴桃汁香氣物質的電子鼻分析

2.1.1 電子鼻傳感器響應值變化 電子鼻模擬人的嗅聞方式獲得樣品整體信息，從而避免感官評價的主觀誤差，具有檢測結果重復性好等特點[15]。電子鼻常用于識別、表征和分級水果香氣在不同種類和品種之間的差異，能夠快速、一致地評估復雜的揮發(fā)性氣體混合物[20]。

電子鼻傳感器陣列的10個傳感器對酶解過程中獼猴桃汁香氣物質的響應值見圖1。由圖1可知，當獼猴桃汁酶解0～8 h，電子鼻傳感器陣列中S1、S3、S4、S5和S9 5個傳感器對獼猴桃汁香氣物質變化的響應值(G/G0)為1.0～2.0，可知其對獼猴桃汁香氣物質的變化不敏感，而傳感器S2、S6、S7、S8和S10對獼猴桃汁香氣成分的響應值(G/G0)>2.0，表現為對獼猴桃汁香氣成分的變化敏感。除S10外，其他傳感器的敏感性與文獻[21]一致；與文獻[21]相比，S9傳感器(對芳香類化合物、有機硫化物敏感)在此次分析中對獼猴桃汁香氣成分的變化不敏感，這可能與試驗原料成熟度相關，提示獼猴桃汁內無揮發(fā)性硫化物或未達到檢出限。S2、S6、S7、S8和S10的響應值隨著酶解時間的增加不斷變化，在0～8 h酶解過程中，響應值在酶解6 h達到最高，隨后略有下降，提示獼猴桃汁在酶解過程中表現出風味強度的變化，存在萜烯類、烷烴類、氮氧化合物、芳香化合物和醇類等傳感器敏感類物質含量的變化，而這些物質含量的動態(tài)變化會影響獼猴桃汁整體風味。

圖1 電子鼻傳感器對不同酶解時間獼猴桃汁香氣物質的響應值

2.1.2 電子鼻傳感器響應值變化的主成分分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)是一種無監(jiān)督的數據分析方法，常用于電子鼻檢測結果分析，用以說明傳感器識別效應和樣品間的區(qū)分度等[16]。本研究將5個傳感器(S7，S6，S2，S8和S10)對酶解0～8 h的獼猴桃汁香氣成分的響應值進行PCA分析，其得分圖和載荷圖如圖2所示。

A.得分圖;B.載荷圖

圖2-A表明，PC1貢獻率為57.6 %，PC2貢獻率為29.9 %，總貢獻率為87.5 %，因此這2個主成分可代表樣品的主要特征。另外，電子鼻可以很好區(qū)分酶解前(0 h)和酶解后(2～8 h)樣品，從PC1角度看，酶解后組樣本位于正向端，而酶解前組樣本位于負向端，表明酶解產生的部分風味物質引起了獼猴桃汁整體風味的變化。對于酶解后組獼猴桃汁來說，酶解2，4，6 h組樣本空間距離不大，表明經過酶解，獼猴桃汁風味成分存在一定變化，具體組成還需要進一步檢測。圖2-B顯示，傳感器S6和S8發(fā)生重合，與其傳感器特征值一致，在第1主成分貢獻率中占主要部分，S7、S10的貢獻率較小。傳感器S6和S8在識別和檢測酶解獼猴桃汁樣品中起著重要作用，說明酶解過程中萜烯類和烷類物質的動態(tài)變化對整體風味的變化有重要影響。此外，傳感器S2在第2主成分中貢獻率最大。上述結果表明，在本研究中電子鼻對獼猴桃汁的揮發(fā)性風味物質感應靈敏，能夠檢測其揮發(fā)性風味物質的變化，通過電子鼻的快速檢測可以監(jiān)測獼猴桃汁的酶解進程，控制酶解果汁的品質。

2.2 酶解獼猴桃汁中香氣物質的GC-MS分析

依據酶解組樣品的電子鼻檢測分析結果，本研究采用SPME-GC-MS技術對獼猴桃汁酶解過程中香氣成分的動態(tài)變化做進一步分析，結果見表2。

表2 GC-MS解析酶解獼猴桃汁中香氣物質的動態(tài)變化

由表2可知，酶解增香后，徐香獼猴桃香氣成分組成和含量十分豐富，從酶解的獼猴桃汁樣品中共分析獲得47種物質，包括醇類8種，醛類11種，酸類4種，萜烯類6種，酯類1種，酮類8種，呋喃類2種，烷烴類7種，主要包括順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、己醇、反-2-己烯醛、乙醛、1,8-桉葉素(又名桉葉油醇)和甲基庚烯酮等，上述揮發(fā)性化合物因其通常具有較低的感官閾值，可以認為是獼猴桃汁主要香氣物質來源[22-23]。進一步分析顯示：徐香獼猴桃汁中醛類物質總量為(3 978.23±438.04)μg/kg，醇類為(3 561.47±219.48)μg/kg，萜烯類為(1 326.56±92.75)μg/kg(其中1,8-桉葉素(1 132.7±76.4)μg/kg)。據文獻[3]報道1,8-桉葉素在海沃德獼猴桃果實中未測得，黃金果獼猴桃果實中為30.1 μg/kg。此外，趙寧等[16]研究表明，徐香獼猴酒中1,8-桉葉素含量為(122.67±3.76)μg/L，顯著高于黃金果獼猴桃酒((67.26±2.77)μg/L)和海沃德獼猴桃酒((2.40±0.39)μg/L)。與0 h相比，酶解處理4 h后，獼猴桃汁香氣物質總量增加20.53%，其中酸類化合物含量增加1 523.10%，呋喃類化合物含量增加441.60%，酮類化合物含量增加23.84%，萜烯類化合物含量增加22.26%，烷烴類化合物增加20.75%，醇類化合物含量增加10.28%，醛類化合物含量增加6.71%。

Garcia等[24]采用柱層析純化軟棗獼猴桃糖苷鍵合態(tài)前體物質，用rapidase酶水解的方式進行結合態(tài)物質釋放，認為糖苷鍵結合態(tài)前體物質經酶解后釋放了呋喃醇(2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮)、反-2-己烯醛、己醛、1-辛烯-3-醇和苯甲酸等揮發(fā)性物質。隨后采用相同方法對海沃德獼猴桃和黃金果獼猴桃進行了分析，結果表明，海沃德獼猴桃中的主要結合態(tài)揮發(fā)性化合物為苯甲醛、反-2-己烯醛、己醛、3-辛醇和2-甲基丁醛等，黃金果獼猴桃中則以呋喃醇(2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮)、苯乙醇、3-羥基-β-大馬酮、己醛和順-3-己烯-1-醇等為主[25]。與上述報道的其他品種獼猴桃經酶解釋放的揮發(fā)性物質相比，本研究中徐香獼猴桃的揮發(fā)性化合物以反-2-己烯醛、己醛、順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、己醇等含量較高，與酶解前(0 h)相比較，酶解4 h上述物質分別增加了6.83%，3.17%，4.64%，10.71%和5.64%。此外，與酶解前(0 h)相比，經過4 h酶解后，獼猴桃汁揮發(fā)性物質中有30種物質含量顯著增加(P<0.05)，主要包括2-丙基庚醇、苯乙醇、2-乙基己酸、苯甲酸、β-蒎烯、2-庚酮、反-2-(2-戊烯基)呋喃等。在本研究中，僅得到一種酯類物質，即反-2-己烯醇乙酸酯，可能與此次研究中選用獼猴桃硬果作為原料有關，其含量在酶解后顯著增加，推測與反-2-己烯醇及乙酸在酶解過程中含量增加有關。

萜烯類化合物呈現特殊的香氣，是水果特征香氣的主要貢獻物質之一。萜烯類化合物多以無味的糖苷態(tài)形式存在，外源添加糖苷酶則是釋放游離態(tài)萜烯化合物的有效方法[13]。由表2可知，徐香獼猴桃汁經過酶解后，相對含量增加最多的萜烯類化合物是β-蒎烯，在酶解過程從無到有；其次是傘花烴，其相對含量增加489.98%；另外，α-松油醇、γ-松油烯、α-畢澄茄油烯和1,8-桉葉素的相對含量也分別增加了200.89%，186.00%，171.64%和22.97%，其中1,8-桉葉素能夠釋放濃郁的薄荷香氣。由以上結果可知，β-葡萄糖苷酶可以有效地酶解結合態(tài)前體物質，促使揮發(fā)性小分子釋放，對提高獼猴桃汁中典型性香氣具有積極影響。

與GC-MS分析方法相比，電子鼻技術具有分析速度快、靈敏度高和檢測費用低等優(yōu)點[18]，但其無法對具體物質組成變化做出預測，GC-MS可以對物質組成進行分析，但耗時較長，對儀器要求高。將GC-MS測得的香氣物質(X)與電子鼻傳感器響應值(Y)進行O2PLS建模(2+1+1)，結果如表3所示。由表3可知，模型中的累計R2Y和累計Q2分別為0.995(≈1.0)和0.762(> 0.5)，表明O2PLS擬合效果較好[17]，這說明獼猴桃汁中揮發(fā)性物質的動態(tài)變化與電子鼻響應值的變化之間存在較好的對應關系。

表3 GC-MS測定的香氣物質(X)與電子鼻傳感器響應值(Y)的O2PLS模型

圖3表明，由O2PLS模型得到的47種揮發(fā)性物質的VIPpred值為0.34～1.44，其中有25種物質的VIPpred>1.0，表明這些香氣物質的變化對電子鼻傳感器響應值的變化貢獻較大，具體分別為β-蒎烯(C25)、反-2-己烯醇乙酯(C28)、反-2-(2-戊烯基)呋喃(C27)、反-2-癸烯(C43)、2-乙基呋喃(C8)、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烯-1-醇(C47)、γ-松油烯(C32)、辛酸(C39)、2-丙基庚醇(C33)、苯乙醇(C35)、癸醛(C41)、香葉基丙酮(C45)、1-戊烯-3-酮(C5)、苯甲酸(C38)、十四烷(C46)、2-乙基己酸(C36)、3-甲基-3-丁烯-2-酮(C4)、1-辛-3-酮(C22)、2-庚酮(C18)、2,5,5-三甲基-1,6-七烯(C31)、乙酸(C2)、1-己烯-3-酮(C9)、3-甲基-2-己烯(C11)、順-2-庚醛(C20)和1-戊烯-3-醇(C6)。

圖3 GC-MS測定的香氣物質(X)與電子鼻傳感器響應值(Y)的O2PLS模型的VIPpred值

3 結 論

獼猴桃汁酶解過程中香氣的動態(tài)變化可以采用電子鼻進行監(jiān)測，其香氣成分的電子鼻響應值變化主要體現在S2、S6、S7、S8和S10這5個傳感器上。獼猴桃汁香氣成分經電子鼻傳感器檢測的強度值隨酶解時間增加，酶解6 h達到最高后略有下降。SPME-GC-MS分析結果表明，經酶解處理后，獼猴桃汁香氣成分中有30種發(fā)生了顯著性增加(P<0.05)，其中順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、1,8-桉葉素、戊醛、己醛、反-2-己烯醛、庚醛、順-2-庚烯醛、辛醛、壬醛、癸醛、2-庚酮和甲基庚烯酮是主要的香氣物質。與未酶解獼猴桃汁相比，酶解處理4 h獼猴桃汁的揮發(fā)性物質總量增加20.53%。因此，酶解處理能作用于獼猴桃汁香氣前體物質，釋放揮發(fā)性香氣物質，提高獼猴桃汁香氣物質總量，該結果可為酶解獼猴桃汁香氣品質控制提供理論依據。