張建峰，王冠雄，黃 佳，姚宗沐，張潔婧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必要元素之一[1],在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用[2]。但是，植物對(duì)磷肥的利用效率僅為5%～25%[3]。磷肥的過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)、植物根系生長(zhǎng)受抑制、土壤中營(yíng)養(yǎng)比例嚴(yán)重失調(diào)等不良結(jié)果。因此，提高磷肥使用效率對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。溶磷微生物通過(guò)分泌有機(jī)酸或質(zhì)子，降低土壤pH，將土壤中的難溶磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷。大量研究表明，溶磷微生物不僅能將難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷供植物利用，而且能分泌生長(zhǎng)素促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4-5]。Ahmad等[6]研究表明，溶磷菌株Q3和Q6使棉花幼苗芽長(zhǎng)分別增加了71%和59%，根長(zhǎng)增加了162%和136%，鮮質(zhì)量分別增加了75%和87%。Ouahmane等[7]研究表明，溶磷菌株P(guān)H4使樟子松幼苗鮮質(zhì)量增加了1.43倍。溶磷微生物數(shù)量約占土壤微生物總量的10%，其種類多樣[8]，包括細(xì)菌[9-10]、真菌[11-12]、放線菌[13-14]。大多數(shù)溶磷微生物只有在適應(yīng)的環(huán)境條件下才會(huì)正常溶磷[15]，惡劣的自然環(huán)境條件會(huì)嚴(yán)重影響其代謝，從而降低其溶磷能力。Hueso等[16]和葉德練等[17]研究表明，干旱脅迫會(huì)影響微生物呼吸，從而影響其活性。目前抗旱能力強(qiáng)的溶磷菌株比較少見。林鳳蓮等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大部分溶磷菌株的溶磷量均隨著干旱脅迫程度的加劇呈顯著下降趨勢(shì)，在重度干旱脅迫下,P6、P7和P25的溶磷量分別下降了74.96%，86.97%和44.43%?？梢姼珊得{迫會(huì)嚴(yán)重抑制溶磷菌的溶磷能力。土壤溫度也是影響土壤微生物生長(zhǎng)最主要的因素[19]，不同的微生物群落有著其特定的溫度適應(yīng)范圍。我國(guó)北方地區(qū)極端最低氣溫為―42 ℃，極端最高氣溫可達(dá)36.1 ℃[20]，溫度過(guò)低會(huì)使微生物減少或停止正常的代謝活動(dòng)，而溫度過(guò)高會(huì)破壞微生物呼吸酶導(dǎo)致微生物不能正常生長(zhǎng)[21]。鞏文峰等[22]研究表明，溶磷菌株P(guān)SB19在10 ℃的低溫條件下生長(zhǎng)良好。李鳴曉等[23]研究表明，在50 ℃下培養(yǎng)溶磷菌株P(guān)1～P5 7 d后，其溶磷量為30.9～47.6 mg/L。目前報(bào)道的溫度適應(yīng)性好、耐干旱的溶磷菌株較少，且多為細(xì)菌，尚未見溶磷真菌的相關(guān)報(bào)道，因此篩選一株抗旱能力強(qiáng)且溫度適應(yīng)性好的溶磷真菌具有重要意義。本課題組前期從吉林西部鹽堿土壤中分離鑒定出一株繩狀青霉菌P1，該菌在適宜溫度下溶磷能力很強(qiáng)，可以達(dá)到1 120.52 mg/L(目前溶磷能力較強(qiáng)的微生物的溶磷量為900～1 100 mg/L)。為了探討繩狀青霉菌P1對(duì)植物生長(zhǎng)的作用及干旱和溫度脅迫對(duì)其溶磷能力的影響，本試驗(yàn)研究了其對(duì)綠豆種子萌發(fā)的影響及其在不同溫度和模擬干旱脅迫下的生物量、溶磷量以及發(fā)酵液pH，以期為生物磷肥的研制提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：繩狀青霉菌(Penicilliumfunicuiosum)P1，篩選自長(zhǎng)春市農(nóng)安縣西的鹽堿土壤，為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)秸稈生物學(xué)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室―80 ℃冰箱中保存菌種。綠豆種子為中綠一號(hào)，購(gòu)買于湖北省宜昌市民源種子專營(yíng)店。

種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然。NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)27 g，蒸餾水1 L，pH 8。

1.2 P1對(duì)綠豆種子萌發(fā)的影響

綠豆種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉溶液消毒1 min，然后用蒸餾水沖洗5次。P1在PDA培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)72 h，用無(wú)菌水制成孢子懸液(1×104CFU/mL)。將綠豆種子用沾蘸法沾P1菌懸液5 s，置于鋪有2層濕濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，保持水的高度在種子的1/2處，以無(wú)菌水處理種子做對(duì)照，每處理重復(fù)3次，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，相對(duì)濕度為85%，記錄綠豆種子的發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。具體計(jì)算公式[24]為：發(fā)芽率(r)=N4/N×100%，其中N4為處理4 d內(nèi)發(fā)芽的種子粒數(shù)，N為供試種子數(shù)；發(fā)芽勢(shì)(p)=N3/N×100%，其中N3為處理3 d內(nèi)發(fā)芽的種子粒數(shù)；發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，其中Gt為每天發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽時(shí)間?；盍χ笖?shù)=第4天幼苗鮮質(zhì)量×發(fā)芽指數(shù)。

1.3 干旱脅迫下P1的溶磷能力測(cè)定

種子懸液的制備:將保存的P1菌種在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，培養(yǎng)72 h后制成孢子懸液(1×108CFU/mL)。向NBRIP培養(yǎng)基中加入聚乙二醇6000(polyethylene glycol，PEG)，制成極輕度(50 g/L PEG)、輕度(100 g/L PEG)、中度(200 g/L PEG)和重度(300 g/L PEG)干旱脅迫培養(yǎng)基[18]。取2 mL種子懸液分別接入到盛有100 mL NBRIP培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，同時(shí)設(shè)定不接種處理為對(duì)照(CK)，于搖床中振蕩培養(yǎng)(28 ℃，160 r/min)，每處理3個(gè)重復(fù)。分別在培養(yǎng)的0，1，2，3，5，7，9，11，13 d測(cè)量溶磷量、pH、P1生物量。pH用酸堿度檢測(cè)儀在室溫(25 ℃)下測(cè)定。P1生物量測(cè)定前，向三角瓶中添加稀鹽酸將剩余磷酸鈣完全溶解，蒸餾水洗滌3次后再用真空抽濾機(jī)過(guò)濾，烘干稱質(zhì)量。取4 mL菌液于12 000 r/min離心5 min，上清液用鉬藍(lán)比色法測(cè)定磷含量。

1.4 溫度脅迫下P1的溶磷能力測(cè)定

P1種子懸液的制備同1.3節(jié)。取2 mL P1種子懸液分別接入到盛有100 mL NBRIP培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，同時(shí)設(shè)定不接種處理為對(duì)照，分別于5，10，12，15，20，25，28，35，40 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)(160 r/min)，每處理3個(gè)重復(fù)。分別在培養(yǎng)的1，2，3，5，7，9，11，13，15，17 d測(cè)量溶磷量、pH、P1生物量，測(cè)定方法見1.3節(jié)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Origin 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 P1對(duì)綠豆種子萌發(fā)的影響

由表1可知，P1菌懸液對(duì)綠豆種子萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用；與CK相比，P1菌懸液使綠豆幼苗的芽長(zhǎng)和發(fā)芽率分別極顯著增長(zhǎng)了149.14%和86.67%，綠豆幼苗的根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量分別顯著增長(zhǎng)了50.21%和44.44%；與CK相比，P1菌懸液使綠豆幼苗的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別極顯著提高了95.33%，132.28%和237.25%；P1菌懸液處理與CK的干質(zhì)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 繩狀青霉菌P1對(duì)綠豆種子萌發(fā)的影響

2.2 干旱脅迫對(duì)P1溶磷能力的影響

由圖1可知，隨著干旱程度的加劇，P1生物量下降，導(dǎo)致其最大溶磷能力逐漸降低。但是，P1溶解磷酸鈣的能力依然很強(qiáng)，在重度干旱脅迫下的溶磷能力仍可達(dá)418.85 mg/L。在培養(yǎng)前5 d內(nèi)，干旱脅迫處理的溶磷量大于對(duì)照，這可能是受干旱脅迫的影響，P1的產(chǎn)酸能力在生長(zhǎng)初期增強(qiáng)，故其溶磷能力隨干旱脅迫的增強(qiáng)而增大。

圖1 干旱脅迫對(duì)繩狀青霉菌P1溶磷能力的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)P1溶磷能力的影響

由表2和表3可知，P1在10～35 ℃下均能夠生長(zhǎng)，并具有溶磷能力，且在28 ℃時(shí)生物量最大，溶磷量在7 d后達(dá)到平臺(tái)期，最大溶磷量可達(dá)1 120.52 mg/L。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于28 ℃時(shí)，P1生物量和溶磷量均明顯下降，并且進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)會(huì)后移，分析可能是由于溫度低導(dǎo)致P1生長(zhǎng)速率變慢，致使產(chǎn)酸速率降低，導(dǎo)致溶磷量下降。如表2，P1在10，12，15，20和25 ℃時(shí)在11 d后達(dá)到平臺(tái)期，最高溶磷量分別為34.67，59.62，493.92，1 082.90和1 092.58 mg/L。當(dāng)培養(yǎng)溫度高于28 ℃時(shí)，P1的生物量和溶磷量也明顯降低，P1在35 ℃時(shí)，最高溶磷量為364.97 mg/L，但最大溶磷量和生物量出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)會(huì)前移，這與高溫增加了微生物的生長(zhǎng)速率，導(dǎo)致產(chǎn)酸速率提高有關(guān)。由此可見，溫度低于或高于28 ℃時(shí)都會(huì)影響P1的溶磷能力。

表3 培養(yǎng)溫度對(duì)繩狀青霉菌P1生物量的影響

由表2～4可知，P1的溶磷能力與pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與生物量基本呈正相關(guān)關(guān)系，這說(shuō)明生物量的累積會(huì)增加P1分泌有機(jī)酸或質(zhì)子的數(shù)量從而促進(jìn)溶磷，也進(jìn)一步說(shuō)明產(chǎn)酸是P1溶解磷酸鹽的主要原因。

表2 培養(yǎng)溫度對(duì)繩狀青霉菌P1溶磷量的影響

表4 培養(yǎng)溫度對(duì)繩狀青霉菌P1 pH的影響

3 討 論

種子萌發(fā)是植物生命周期中最關(guān)鍵的階段之一，研究表明根際促生菌(PGPR)可促進(jìn)種子萌發(fā)[25]。Yoo[26]研究表明，蘿卜種子接種A.chroococcum孢子懸浮液(1×107CFU/mL)培養(yǎng)4 d后，與未接種對(duì)比，芽長(zhǎng)提高了20 mm，根長(zhǎng)提高了28 mm，發(fā)芽率提高了41.67%。Delgado-Sánchez等[27]的研究表明，真菌的孢子懸液有助于打破種子休眠期而提升發(fā)芽率。Zhao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，接種HPP16菌懸液的綠豆發(fā)芽率比CK提高了35.48%。本研究中，P1對(duì)綠豆種子萌發(fā)的促生作用明顯優(yōu)于HPP16。菌株P(guān)1的菌懸液對(duì)綠豆種子萌發(fā)有較好的促生效果，可能是其菌懸液在接種至綠豆種子的4 d內(nèi)，孢子萌發(fā)形成菌絲體，菌絲體釋放生長(zhǎng)素(IAA和鐵載體)，促進(jìn)了綠豆種子萌發(fā)。但是，大多數(shù)溶磷微生物只有在適宜的環(huán)境條件下才會(huì)正常溶磷[29]，惡劣的自然環(huán)境條件會(huì)嚴(yán)重影響微生物的代謝，從而影響其功能。P1如果具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，將是一株非常有潛力應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的溶磷菌。因此，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)對(duì)P1的環(huán)境適應(yīng)能力進(jìn)行研究。

干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響微生物呼吸、生長(zhǎng)和活性[16-17]。在本研究中，隨著干旱程度的加劇，P1的最大溶磷能力逐漸降低，這與林鳳蓮等[18]的研究結(jié)果相似，但P1在重度干旱脅迫下的溶磷量仍然可達(dá)418.85 mg/L，是文獻(xiàn)[18]中菌株P(guān)8和P19溶磷量的3倍多。

溫度是影響微生物活性的重要因素，低溫會(huì)對(duì)細(xì)胞膜、酶活性及DNA復(fù)制和細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重的破壞[30]。同樣，溫度過(guò)高酶會(huì)失去活性，使代謝發(fā)生障礙。因此篩選一株對(duì)溫度適應(yīng)性強(qiáng)的溶磷菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重大意義。鞏文峰等[22]研究表明，溶磷菌株P(guān)SB19在4～30 ℃的條件下均能生長(zhǎng)，但在20 ℃以下生長(zhǎng)有所延遲。P1在10～35 ℃的條件下均能生長(zhǎng)，在20 ℃以下生長(zhǎng)延遲且生物量低，這是因?yàn)殡S著溫度的降低,微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性下降，使得代謝過(guò)程中各種生化反應(yīng)速度減慢，破壞了生化反應(yīng)的協(xié)調(diào)性，導(dǎo)致微生物的繁殖速度減慢[21]。但P1的解磷能力與同類菌相比仍然較高，梁艷瓊等[31]的研究結(jié)果表明，黑曲霉PSFM在34 ℃下培養(yǎng)6 d后，發(fā)酵液中溶磷量達(dá)到317.45 mg/L，而菌株P(guān)1在35 ℃時(shí)溶磷量可達(dá)364.97 mg/L。

4 結(jié) 論

繩狀青霉菌P1對(duì)綠豆種子萌發(fā)有良好的促生效果，使綠豆幼苗的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)分別增長(zhǎng)了149.14%和50.21%，使發(fā)芽率提高了86.67%，種子活力指數(shù)提升了237.25%。P1在干旱脅迫下仍具有很強(qiáng)的溶磷能力，在重度干旱脅迫下溶磷量可達(dá)418.85 mg/L。P1在10～35 ℃的條件下均能生長(zhǎng)且具備溶磷能力，10 ℃時(shí)溶磷量可達(dá)34.67 mg/L，35 ℃時(shí)溶磷量可達(dá)364.97 mg/L。由此可見，繩狀青霉P1是一株對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較好且能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌株，是制備微生物菌肥的良好菌種。