宋吉玲，陸 娜，閆 靜，亢學(xué)平，黃小蘇，周小華

(1 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024；2 延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133001；3 桐廬縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 桐廬 311500)

黑木耳隸屬木耳目木耳科木耳屬，俗稱云耳、細(xì)木耳[1]，其子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、粗纖維、碳水化合物及人體必需氨基酸，具有降血脂[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化和延緩衰老[6]等多種功效。

黑木耳作為我國(guó)三大食用菌栽培品種之一，其年產(chǎn)量?jī)H次于平菇和香菇[7]。隨著“北耳南擴(kuò)”[8]產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，浙江、福建等南方地區(qū)袋栽黑木耳“全日光間歇噴霧栽培模式”得到了快速發(fā)展，形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模[9]。而南方市場(chǎng)上的黑木耳菌株大多是從東北引進(jìn)的，同名異物和同物異名的現(xiàn)象頻發(fā)，同時(shí)由于菌種擴(kuò)繁的不規(guī)范，常常造成菌種質(zhì)量、產(chǎn)量和抗性差的情況出現(xiàn)，嚴(yán)重制約了黑木耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而且由于南北氣候條件差異較大，北方選育的黑木耳品種不一定適應(yīng)南方高熱高濕的氣候條件，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)耳片大、顏色偏黃、產(chǎn)量低的現(xiàn)象。因此為了更好地鑒別黑木耳種質(zhì)資源之間的遺傳差異，并篩選出適合南方地區(qū)栽培的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)黑木耳菌株，從分子生物學(xué)和傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀方面對(duì)不同來(lái)源的黑木耳菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)分析就顯得尤為重要[10-13]。目前關(guān)于黑木耳品種篩選評(píng)價(jià)方面的研究報(bào)道較多，杜萍等[14]通過(guò)對(duì)16個(gè)黑木耳菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)、栽培農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，篩選出6個(gè)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)黑木耳菌株；郭曉帆等[15]通過(guò)比較5個(gè)黑木耳菌株在母種、原種和栽培種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況、栽培及產(chǎn)量性狀等，篩選出朵型好、顏色黑，出耳快、齊，產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)菌株Au29；鄭素月等[16]對(duì)北方地區(qū)19個(gè)黑木耳菌株的菌絲和出耳性狀進(jìn)行比較分析，篩選出適宜河北地區(qū)栽培的4個(gè)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)黑木耳菌株(野森一代、黑丹一代、黑山和黑耳厚)。以上研究多注重從子實(shí)體商品性和產(chǎn)量方面對(duì)黑木耳菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，而對(duì)菌絲生長(zhǎng)情況、子實(shí)體農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量之間相關(guān)性的研究相對(duì)較少。為此，本研究通過(guò)ISSR技術(shù)對(duì)15個(gè)黑木耳菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行分析,同時(shí)結(jié)合菌絲生長(zhǎng)速度、產(chǎn)量和子實(shí)體農(nóng)藝性狀，篩選出適合南方地區(qū)栽培的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)黑木耳菌株，并對(duì)其農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量間的相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在為優(yōu)質(zhì)黑木耳種源選育和精準(zhǔn)化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共15個(gè)，均為杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育、收集、保藏的菌株，詳細(xì)情況見表1。

表1 15個(gè)供試黑木耳菌株的信息

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

原種培養(yǎng)基：木屑83%，麩皮15%，石灰1%，石膏1%，含水量為55%～60%。

栽培種培養(yǎng)基：木屑88%，麩皮10%，石灰1%，石膏1%，含水量約為60%。

按栽培黑木耳的常規(guī)方法生產(chǎn)菌棒，使用15 cm×55 cm×0.05 mm的聚乙烯栽培袋裝袋，每個(gè)菌株接種150棒，設(shè)3個(gè)重復(fù)，菌棒接種后置于25 ℃條件下培養(yǎng)，待菌絲成熟后按常規(guī)方法進(jìn)行出耳管理。

1.3 ISSR引物

從美國(guó)哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的100條ISSR通用引物中篩選出多態(tài)性高、擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的11條引物，委托杭州擎科生物公司合成。引物信息詳見有2。

1.4 黑木耳菌絲體的培養(yǎng)

從PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌落邊緣取2 mm×2 mm的菌絲塊，接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃淺層靜置培養(yǎng)10 d，收集菌絲，無(wú)菌水漂洗2次，無(wú)菌濾紙吸干水分，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 黑木耳遺傳差異分析

1.5.1 黑木耳基因組DNA的提取及檢測(cè) 供試15個(gè)黑木耳菌株基因組DNA參照新型快速植物基因組DNA提取試劑(BioTeke，北京)的說(shuō)明提取，提取后測(cè)定DNA的濃度，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹17]。

1.5.2 ISSR多態(tài)性分析 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TC-XP型PCR儀(博日科技有限公司Bioer，杭州)上進(jìn)行。ISSR-PCR擴(kuò)增體系為：2×TSINGKE PCR Master(blue)預(yù)混體系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板(20 ng/μL)3 μL，用ddH2O補(bǔ)齊到20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，適當(dāng)溫度退火(退火溫度視引物而定，具體見表2)30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，16 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳檢測(cè)，150 V電泳30 min。采用Chemi Doc XRS imaging system(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)對(duì)擴(kuò)增圖譜進(jìn)行拍照，有ISSR譜帶標(biāo)記為1，無(wú)ISSR譜帶標(biāo)記為0，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算遺傳相關(guān)系數(shù)，采用平均連鎖法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得到聚類圖譜。

表2 11條ISSR引物序列及退火溫度

1.6 黑木耳農(nóng)藝性狀的觀測(cè)

記錄不同黑木耳菌株菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、現(xiàn)耳芽時(shí)間、出耳整齊度、耳片形狀、耳脈情況、耳片顏色等性狀，并測(cè)定耳片長(zhǎng)度、寬度、厚度和產(chǎn)量等指標(biāo)[18]。其中菌絲生長(zhǎng)速度每隔5 d測(cè)量1次，記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)，計(jì)算平均生長(zhǎng)速度。菌絲平均生長(zhǎng)速度(cm/d)=菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度(cm)/菌絲生長(zhǎng)天數(shù)(d)。耳片性狀選取第1潮30～50個(gè)鮮耳進(jìn)行測(cè)定。耳片大小用游標(biāo)卡尺“十”字形測(cè)量耳片直徑，子實(shí)體顏色深淺度為黑色、黃褐色、灰褐色。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和LSD檢驗(yàn)。P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著。采用Pearson相關(guān)性分析法[19]分析菌絲生長(zhǎng)情況、子實(shí)體農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 15個(gè)黑木耳菌株的ISSR多態(tài)性分析

利用ISSR引物對(duì)供試的15個(gè)黑木耳菌株基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ISSR-PCR擴(kuò)增圖譜顯示，11條ISSR引物在15個(gè)黑木耳菌株間擴(kuò)增出了71條清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性片段，片段長(zhǎng)度為200～2 000 bp。引物UBC807的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其他引物擴(kuò)增圖略。

M.DNA Marker;A1～A15.黑木耳菌株編號(hào)，見表1

2.2 15個(gè)黑木耳菌株的聚類分析

從聚類結(jié)果(圖2)可以看出，A13與A14和A15之間的遺傳相似水平高于0.90，A14與A15相似系數(shù)達(dá)0.97，初步確認(rèn)A14和A15為同一菌株，而A13與A14和A15菌株的親緣關(guān)系較近。在相似系數(shù)為0.50時(shí)可將15個(gè)黑木耳菌株分為2個(gè)類群。第一類群包括A1、A2、A3、A5、A6、A7、A10、A11、A12、A13、A14、A15共12個(gè)菌株；第二類群包括A4、A8和A9共3個(gè)菌株。15個(gè)黑木耳菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.50～0.97，表明黑木耳遺傳差異較大，遺傳背景十分豐富。

圖2 15個(gè)黑木耳菌株的聚類分析結(jié)果

2.3 15個(gè)黑木耳菌株菌絲的生長(zhǎng)情況

由表3可知，不同黑木耳菌株母種菌絲長(zhǎng)勢(shì)差異不明顯，除A7菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)稍弱外，其余菌株均長(zhǎng)勢(shì)良好。其中A11、A12、A8和A9菌株菌絲生長(zhǎng)較快，平均生長(zhǎng)速度分別為0.258，0.247，0.247和0.243 cm/d；其次為A6、A14、A1、A15、A13、A10、A2、A4、A3和A7菌株；生長(zhǎng)最慢的為A5菌株，平均生長(zhǎng)速度為0.190 cm/d。15個(gè)黑木耳菌株整體抗雜性均表現(xiàn)較好，無(wú)污染現(xiàn)象發(fā)生。

由表3還可知，不同黑木耳菌株栽培種長(zhǎng)勢(shì)差異不明顯，整體表現(xiàn)菌絲潔白、濃密、整齊。其中A4、A5、A3和A10菌株菌絲生長(zhǎng)較快，平均生長(zhǎng)速度分別為0.449，0.447，0.442和0.439 cm/d；其次為菌株A6、A7、A2、A14、A12、A1、A15、A11、A13和A9菌株；生長(zhǎng)最慢的為A8菌株，平均生長(zhǎng)速度僅為0.372 cm/d，與其他菌株存在顯著差異。

2.4 15個(gè)黑木耳菌株的產(chǎn)量

由表3可知，15個(gè)黑木耳菌株中，A6、A5、A3和A4的產(chǎn)量較高，分別為87.55，83.24，82.36和79.45 g/棒；其次為A8、A9、A15、A10、A13和A14；A11、A12、A1、A7和A2的產(chǎn)量較低，分別為59.36，58.18，57.53，53.26和49.30 g/棒。因此從產(chǎn)量性狀來(lái)看，可以淘汰產(chǎn)量較低的A11、A12、A1、A2和A7菌株。

表3 15個(gè)黑木耳菌株的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)量情況

2.5 15個(gè)黑木耳菌株的農(nóng)藝性狀

由表4可知，各參試菌株打孔后現(xiàn)耳芽時(shí)間為20～36 d，其中A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11菌株現(xiàn)耳芽時(shí)間最短，為20～25 d；A12和A13菌株現(xiàn)耳芽時(shí)間較短，均為30 d；A1、A2、A14和A15菌株現(xiàn)耳芽時(shí)間較長(zhǎng)，分別為36，35，31和32 d，菌棒易脫水，培養(yǎng)中后期菌棒變軟、長(zhǎng)青苔、污染，因此應(yīng)淘汰這4個(gè)菌株。

由表4還可知，在15個(gè)供試菌株中，耳片形狀多以單片為主，少量朵狀；6個(gè)菌株的耳片顏色為黑色，7個(gè)菌株為黃褐色，2個(gè)菌株為灰褐色；耳片長(zhǎng)度為5.236～6.139 cm，寬度為4.068～4.608 cm，厚度為1.722～2.262 mm。在耳片厚度方面，A1和A6菌株耳片厚(厚度>2.0 mm)，A5、A9、A10、A14和A15菌株耳片薄(厚度<1.8 mm)；在耳片大小方面，A1、A3、A4、A6、A8和A9菌株耳片小(長(zhǎng)×寬<5.40 cm×4.35 cm)，A5和A14菌株耳片大(長(zhǎng)×寬>6.0 cm×4.5 cm)，其余菌株耳片大小比較適中。出耳整齊度也是影響黑木耳產(chǎn)量和質(zhì)量的一個(gè)重要因素[20]，由表4可知，除A1、A13、A14和A15菌株出耳不整齊外，其余菌株表現(xiàn)良好。

表4 15個(gè)黑木耳菌株的農(nóng)藝性狀分析

綜合分析菌株的農(nóng)藝性狀可知，15個(gè)供試菌株中，A6菌株出耳快、齊，耳片顏色黑、小，產(chǎn)量高，適宜作為推廣品種使用；A13菌株出耳不整齊，A9和A10菌株耳片薄，A1、A2、A14和A15菌株現(xiàn)耳芽時(shí)間長(zhǎng)、菌棒易污染，因此這些菌株應(yīng)被淘汰；在產(chǎn)量性狀表現(xiàn)較好的A3、A4、A5和A8菌株中，A3、A5耳片為黃褐色、筋多，A4菌株耳片稍薄，A8耳片黃褐色、薄，因此這4個(gè)菌株不太適合栽培推廣，但可作為與抗性強(qiáng)、商品性優(yōu)良的品種進(jìn)行雜交育種的親本材料使用。

2.6 黑木耳產(chǎn)量與栽培及農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

通過(guò)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，黑木耳產(chǎn)量與耳片厚度、栽培種菌絲平均生長(zhǎng)速度具有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.347和0.383；與現(xiàn)耳芽時(shí)間則表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為―0.698；與耳片長(zhǎng)度、耳片寬度和母種菌絲平均生長(zhǎng)速度的相關(guān)性不大。

表5 黑木耳產(chǎn)量與栽培及農(nóng)藝性狀的相關(guān)性

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物遺傳多樣性研究中，而ISSR作為一種操作簡(jiǎn)單、快捷、高效的檢測(cè)手段，常常用于食用菌遺傳多態(tài)性分析和種內(nèi)菌株親緣關(guān)系的區(qū)分。任廣明等[21]運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黑龍江伊春地區(qū)的23個(gè)黑木耳主栽品種進(jìn)行遺傳差異分析，發(fā)現(xiàn)23個(gè)黑木耳菌株在相似系數(shù)為0.8時(shí)聚為3個(gè)類群，遺傳背景差異不大，親緣關(guān)系較近。而徐安然等[22]利用SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)源于全國(guó)不同地區(qū)的72份黑木耳栽培種和野生種菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析及分子身份證的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其遺傳差異比較大，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有同物異名的現(xiàn)象存在。李輝平等[23]應(yīng)用ISSR技術(shù)對(duì)21個(gè)栽培黑木耳進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明我國(guó)栽培黑木耳的遺傳背景十分豐富，遺傳多樣性很高。姚方杰等[24]基于毛木耳全基因組開發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)27份毛木耳菌株的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明供試菌株遺傳相似系數(shù)為0.618～0.971，說(shuō)明毛木耳種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)15個(gè)黑木耳菌株基因組DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)⒑谀径陞^(qū)分開來(lái)，并將15個(gè)菌株聚為2個(gè)類群，一類為來(lái)自浙江地區(qū)的菌株，另一類以東北地區(qū)菌株為主，但并未發(fā)現(xiàn)黑木耳菌株農(nóng)藝性狀與地域分布之間存在相關(guān)性。這與李黎等[25]的研究結(jié)果不同，可能與目前我國(guó)各地相互引種、菌種來(lái)源不明確有關(guān)。

農(nóng)藝性狀作為評(píng)價(jià)種質(zhì)資源是否優(yōu)良的一個(gè)重要指標(biāo)，在栽培試驗(yàn)過(guò)程中，研究者多是以子實(shí)體商品性和產(chǎn)量為主要評(píng)價(jià)內(nèi)容。杜萍等[14]、郭曉帆等[15]及鄭素月等[16]從菌絲長(zhǎng)勢(shì)、產(chǎn)量、子實(shí)體商品性等方面對(duì)黑木耳菌株進(jìn)行農(nóng)藝性狀的比較分析，篩選出適宜栽培的優(yōu)良菌株。金鑫等[26]從菌絲長(zhǎng)勢(shì)、子實(shí)體農(nóng)藝性狀、多糖和麥角甾醇等方面篩選出適宜西南地區(qū)栽培的黑木耳品種。孫靖軒[27]通過(guò)對(duì)70個(gè)親本菌株的產(chǎn)量、熟性、朵型和鮮耳腹面顏色比較分析篩選出親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、性狀具有互補(bǔ)性的優(yōu)良親本黑29和黑威9號(hào)。本研究通過(guò)對(duì)黑木耳菌株的菌絲生長(zhǎng)、子實(shí)體農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，篩選出適合南方地區(qū)栽培的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)A6(黑山)菌株和適宜作為育種材料使用的A3(916)、A4(Aa7)、A5(黑2)和A8(麗黑1號(hào))菌株。同時(shí)，本試驗(yàn)通過(guò)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)耳芽時(shí)間與產(chǎn)量之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，即現(xiàn)耳芽時(shí)間越短產(chǎn)量越高；栽培種生長(zhǎng)速度、耳片厚度與產(chǎn)量之間存在一定程度的正相關(guān)性，而母種菌絲生長(zhǎng)速度與產(chǎn)量之間相關(guān)性不大，因此現(xiàn)耳芽時(shí)間和栽培種菌絲平均生長(zhǎng)速度可以作為衡量菌株是否高產(chǎn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，出耳整齊度與產(chǎn)量之間存在一定的相關(guān)性，但兩者之間具體有何種關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。