何小奪吳 迪?吳隆飛陳 健丁玉川

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中美神經(jīng)科學(xué)研究所,北京 100053; 2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 100053)

缺血性腦卒中是導(dǎo)致嚴(yán)重的功能缺失和死亡的腦血管病之一,目前臨床上被證實(shí)治療卒中有效的方法只有溶栓和取栓治療[1]。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),治療性低溫具有降低局部腦缺血后腦損傷以及減輕繼發(fā)性損傷的功效[2]。但是目前為止治療性低溫在缺血性腦卒中方面的保護(hù)作用尚未得到臨床證實(shí)[1]。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物動(dòng)物模型上開展的轉(zhuǎn)化研究將為治療性低溫的最終臨床應(yīng)用提供重要的依據(jù)[3]。

非人靈長(zhǎng)類(nonhuman primates, NHPs)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史,由于其在親緣關(guān)系上與人類最接近,與人類的遺傳物質(zhì)有75%～85%的同源性,在生理結(jié)構(gòu)以及免疫代謝方面與人類高度相似,是醫(yī)學(xué)研究中具有極高價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]。NHPs 在腦卒中轉(zhuǎn)化研究中具有巨大的轉(zhuǎn)化研究?jī)?yōu)勢(shì)。相比于嚙齒類動(dòng)物,NHPs 的止凝血成分、腦組織解剖結(jié)構(gòu)與人類相似,適合作為臨床實(shí)驗(yàn)前的動(dòng)物載體。

低溫治療是目前公認(rèn)的、明確的神經(jīng)保護(hù)作用,可減輕動(dòng)物和人的各種腦損傷。低溫治療在心臟外科和神經(jīng)外科手術(shù)中應(yīng)用逐漸廣泛,取得良好的腦保護(hù)作用,但體溫低于28℃時(shí),常誘發(fā)心律失常、凝血機(jī)制障礙等嚴(yán)重并發(fā)癥。近期研究發(fā)現(xiàn),腦溫下降2～3℃的亞低溫對(duì)缺血性腦損傷也有保護(hù)作用,且無(wú)深低溫所致的各種并發(fā)癥,使低溫治療重新引起人們的興趣[5]。近幾年,使用亞低溫治療腦缺血、腦缺氧和腦出血患者,取得了令人囑目的研究成果。臨床證據(jù)表明,輕度至中度低溫(降低2～5℃)可安全有效地減少細(xì)胞死亡,改善腦缺血后的功能預(yù)后[6-8]。但是,在臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中,由于低溫誘導(dǎo)速度、持續(xù)時(shí)間、復(fù)溫速度等不確定性,近期低溫治療的臨床研究均得到陰性結(jié)果。鑒于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在低溫轉(zhuǎn)化研究中的重要作用,我們將綜述靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型上進(jìn)行的低溫研究以及在局部腦缺血模型中的應(yīng)用。

1 靈長(zhǎng)類動(dòng)物常用低溫方法

1.1 全身低溫方法

目前常用的全身低溫方法包括循環(huán)水泵低溫、制冷墊低溫、置入鈦冷卻板低溫、灌注低溫等。這幾種方法能夠控制液體溫度、灌注速度和時(shí)間,有利于對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的溫度進(jìn)行調(diào)控。

循環(huán)水泵低溫方法是由冷卻系統(tǒng)控制誘導(dǎo)的,包括一個(gè)冷卻帽、冷水毯,和一個(gè)循環(huán)水泵。初始溫度8℃～12℃。所有恒河猴的體溫由直腸溫度傳感器的反饋,有控制算法通過(guò)修改水溫進(jìn)行回應(yīng)。精確控制模型的目標(biāo)溫度,包括輕度低溫,溫度控制在 35.0℃ ～36.5℃,中度低溫,溫度控制在<35.0℃。這是一種無(wú)創(chuàng)的、有效的和精確的方式管理體溫,研究中目標(biāo)體溫維持72 h。這種低溫方法選擇幼年恒河猴作為動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)輕度低溫可以降低七氟烷麻醉造成的神經(jīng)功能損傷,降低凋亡水平。這種方法簡(jiǎn)便、易于調(diào)控,可以嚴(yán)格控制低溫目標(biāo)溫度和時(shí)長(zhǎng)[9-10]。

另一種常用的全身低溫方法為液體灌注,將體溫(直腸溫度)控制在較低水平。該方法常用于心臟手術(shù)中的體外循環(huán)過(guò)程,經(jīng)股動(dòng)脈灌注液體后平均需要(35±7) min 達(dá)到目標(biāo)溫度(15℃)。冷卻過(guò)程中流量逐漸減少至60 mL/(kg·min)并維持[上套管為 20 mL/(kg·min),下套管為 40 mL/(kg·min)]直至松開主動(dòng)脈。研究發(fā)現(xiàn),低溫的保護(hù)作用與降低主動(dòng)脈阻斷后脊髓下胸和腰段的脊髓血流再灌注損傷密切相關(guān)。在胸腹主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤修補(bǔ)術(shù)中,低溫心肺轉(zhuǎn)流所產(chǎn)生的深度低溫可能是一種保護(hù)脊髓的有效方法,并可能降低脊髓缺血性損傷的發(fā)生率。研究者使用成年雄性狒狒,主動(dòng)脈鉗夾夾閉血管,制作動(dòng)脈夾夾閉脊髓缺血模型,主動(dòng)脈鉗夾前冷卻至直腸溫度15℃,并在此溫度下進(jìn)行體外循環(huán),直到主動(dòng)脈被松開[11]。他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)低溫后存活下來(lái)的動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)損傷顯著降低,但是深度低溫也伴隨了一定的死亡概率。

1.2 局部低溫方法

冷熱墊(ChillerPad)裝置是另一種局部低溫方法,包括一個(gè)由鑄型聚氨酯制成的20×25 mm 厚的冷墊,泡沫絕緣輸入輸出油管,電腦控制的泵,熱電冷卻器。在恒河猴創(chuàng)傷性腦損傷后2.5 h,將冷卻墊放置在硬腦膜上,通過(guò)激活水泵和熱電冷卻裝置開始降溫。皮質(zhì)表面迅速冷卻到15℃并保持24 h,隨后冷卻裝置再?gòu)?15℃ ～37℃復(fù)溫。復(fù)溫方式2.5℃ /h,大約復(fù)溫 10 h。Ikonomidou 等[9]選用成年恒河猴,此低溫方法可以用于外科手術(shù)開顱后、創(chuàng)傷性腦損傷后的局部低溫,該方法具有快速降溫、低溫穩(wěn)定、復(fù)溫可控等優(yōu)點(diǎn),但是該方法需要局部保留硬腦膜,可能限制其應(yīng)用[12]。

另一種局部低溫方法采用環(huán)形熱電設(shè)備對(duì)大腦皮層表面進(jìn)行局部冷卻。將電熱芯片黏在橢圓形的空心銅散熱器的底部。通過(guò)冷鹽水(0℃～4℃,90 mL/min)灌注到散熱器中進(jìn)行熱量交換,實(shí)現(xiàn)快速有效的降溫。用螺絲將整個(gè)冷卻裝置固定在頭骨上,儀器只接觸到大腦皮層表面,通過(guò)溫度控制系統(tǒng)準(zhǔn)確控制降溫速度、低溫水平、持續(xù)時(shí)間和正常復(fù)溫。研究中納入5 只成年食蟹猴,將低溫組溫度分別為20℃、18℃、16℃。他們發(fā)現(xiàn) 20℃低溫對(duì)癲癇的控制作用最佳[13]。另一項(xiàng)研究中將 352mm2的鈦冷卻板埋入獼猴大腦的硬膜外表面,實(shí)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)和維持。7 min 后大腦皮層表面腦溫降至15℃,并保持冷卻溫度30 min,通路冷卻板灌注低溫乳酸林格氏液,實(shí)現(xiàn)溫度控制。腦表面溫度(15±0.2)℃,液體流入溫度(12±0.4)℃。冷卻停止,停止循環(huán)冷卻劑,復(fù)溫時(shí)皮層溫度同樣在7 min 內(nèi)升至35℃,復(fù)溫時(shí)間約15 min。此方法發(fā)現(xiàn)重度低溫(15℃)可持續(xù)抑制癲癇發(fā)作,并且在降溫和復(fù)溫過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)異常[14]。

1.3 自體血低溫保護(hù)方式

自體血低溫也是一種特殊全身低溫方法,冷血灌注可迅速降低體溫,并使體溫降低到一定程度,從而產(chǎn)生有意義的神經(jīng)保護(hù)作用。這種技術(shù)在減少手術(shù)干擾、設(shè)備簡(jiǎn)單、對(duì)血液的需求最小等方面具有全身灌注的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),由于其通過(guò)冷卻動(dòng)物模型的自身血液,對(duì)模型目標(biāo)溫度、持續(xù)時(shí)間的調(diào)控更加準(zhǔn)確和精準(zhǔn)。Schwartz 等[7]和 Arthur 等[15]在狒狒上證實(shí)低溫保護(hù)方式。暴露錐動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈,通過(guò)頸部的正中切口。局部腦低溫通過(guò)一個(gè)小型熱交換器完成。從股動(dòng)脈中泵出血液經(jīng)過(guò)交換器泵入頸總動(dòng)脈中的T 型套管,放置后即刻開始灌注,兩椎動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈立即恢復(fù)在灌注,在未灌注側(cè)的頸動(dòng)脈分叉處和雙側(cè)頸外動(dòng)脈均通過(guò)預(yù)設(shè)的圈套結(jié)扎血管。通過(guò)一個(gè)單獨(dú)的頸內(nèi)動(dòng)脈為大腦提供低溫血液,并在很大程度上防止了全身的暖血對(duì)腦血管的干擾。灌注開始時(shí)的流速與動(dòng)物的腦血流量相等。達(dá)到目標(biāo)溫度,灌注流速就降低到維持水平。大腦溫度保持恒定持續(xù)的低溫灌注30 min。結(jié)果表明,灌注單側(cè)頸總動(dòng)脈與灌注單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈大腦冷卻速度相同、效果一致。低溫灌注7 ～8 min 后,記錄的大腦不同區(qū)域的最大溫差為2.7℃。大腦不同區(qū)域溫度相差約1℃。單一頸內(nèi)動(dòng)脈冷卻34 min 至大腦深部溫度7℃。Mack 等[16]導(dǎo)管被置入股靜脈后進(jìn)入下腔靜脈。造模缺血6 h 后,冷卻到目標(biāo)溫度32℃持續(xù)3 h(185.3±17.5) min。通過(guò)核心溫度反饋來(lái)控制冷卻系統(tǒng),并在整個(gè)卒中誘導(dǎo)、再灌注、冷卻和再升溫過(guò)程中記錄核心和大腦溫度。用加熱毯將動(dòng)物加熱(1.0±0.1)℃ /h 到正常核心溫度(36.5±0.5)℃用時(shí)超過(guò)6 h。[7,15-17]

通過(guò)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦低溫灌注研究發(fā)現(xiàn),該方法降溫快速、穩(wěn)定,低溫的大腦可以通過(guò)以低流速持續(xù)灌注冷血來(lái)維持所需的溫度水平。體溫保持的相對(duì)較好,但全身血壓和心率等全身不良反應(yīng)較為嚴(yán)重,可能顯著影響低溫保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn),腦溫度維持在8℃～9℃時(shí),出現(xiàn)2 只動(dòng)物死亡現(xiàn)象[15]。如何保留低溫的保護(hù)作用,降低其不良反應(yīng)值得深入研究。

1.4 血管內(nèi)低溫保護(hù)方式

Wang 等[18]采用介入方法,將微導(dǎo)管置于大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery, MCA),在正常恒河猴模型上評(píng)估局部低溫效果。研究者將100 mL 林格氏液(4℃)經(jīng)過(guò)微導(dǎo)管注入大腦中動(dòng)脈。經(jīng)大腦中動(dòng)脈局部灌注冷的林格氏液能迅速降低大腦皮層和紋狀體區(qū)的溫度,在皮層,降幅從(37.7±0.1)℃降低到(34.0±0.6)℃,在紋狀體從(37.6±0.1)℃降至(33.9±0.3)℃。局部大腦中動(dòng)脈灌注乳酸林格氏液20 min 后大腦溫度降到最低的治療溫度。因此,局部血管內(nèi)低溫具有降溫速度快以及血管內(nèi)介入方法可以協(xié)同應(yīng)用的巨大優(yōu)勢(shì)。局部低溫林格氏液灌注后直腸溫度僅從(37.5±0.2)℃降為(37.1±0.2)℃(P<0.05)。所監(jiān)測(cè)的主要生理體征指標(biāo)(血壓、動(dòng)脈血氧含量、呼吸頻率、心率等)均在正常范圍波動(dòng)。所有模型動(dòng)物均能耐受局部低溫,未出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥導(dǎo)致的生命體征變化和行為學(xué)改變。以上結(jié)果顯示,血管內(nèi)局部低溫對(duì)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型具有安全性。

2 低溫治療方法在靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦缺血模型中的應(yīng)用

2.1 ET-1 模型制作

內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1) 是一種血管收縮劑,常用來(lái)誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物和狨猴局部腦缺血[19]。近期有研究報(bào)道,采用ET-1 成功誘導(dǎo)恒河猴局部腦缺血[6]。ET-1 可誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物局灶性腦缺血是研究腦卒中機(jī)制及腦卒中后修復(fù)的潛在的模型。

以上研究中,通過(guò)局部開顱手術(shù),暴露靈長(zhǎng)類動(dòng)物的大腦中動(dòng)脈,局部給予ET-1 后,大腦中動(dòng)脈閉塞,實(shí)現(xiàn)局部腦缺血。術(shù)后影像學(xué)研究顯示,注射ET-1 后7 d 出現(xiàn)梗死灶、腦水腫等表現(xiàn),行為學(xué)評(píng)估發(fā)現(xiàn),模型動(dòng)物出現(xiàn)手部精細(xì)運(yùn)動(dòng)障礙等神經(jīng)功能缺損癥狀。局部注射ET-1 的方法易于操作,但是每只模型動(dòng)物對(duì)于ET-1 反應(yīng)不完全相同,而且不能控制缺血和再通時(shí)間,出現(xiàn)的臨床癥狀通常較輕[20]。

目前有文獻(xiàn)報(bào)道給予大鼠ET-1 誘導(dǎo)局部腦缺血后,局部低溫可以減輕神經(jīng)損傷。但是,尚無(wú)靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道。由于注射ET-1 需要開顱,所以首選低溫方法應(yīng)該是置入鈦冷卻板低溫或冰帽低溫。優(yōu)點(diǎn)是可以直接針對(duì)大腦物理降溫,液體溫度、作用時(shí)間、流速都是可控的。也可以在再灌注后連接自體血低溫或血管內(nèi)低溫。

2.2 動(dòng)脈夾閉模型制作

研究者通常采用翼點(diǎn)入路法開顱,然后進(jìn)行動(dòng)脈夾閉造成局部腦缺血。此方法優(yōu)點(diǎn)是動(dòng)脈夾簡(jiǎn)便易行很容易得到,缺血和再通時(shí)間均可控。缺點(diǎn)是由于手術(shù)中需要開顱,導(dǎo)致顱內(nèi)壓改變,因此出現(xiàn)的造模后相關(guān)并發(fā)癥,術(shù)后創(chuàng)傷感染幾率大增,影響術(shù)后行為學(xué)評(píng)估嚴(yán)重時(shí)危及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命[7,15,21-22]。

Schwartz 等[7]和 Huang 等[23]在狒狒上進(jìn)行動(dòng)脈夾閉模型的制作,血管閉塞是通過(guò)在左側(cè)大腦前動(dòng)脈近端至前交通動(dòng)脈處,右側(cè)大腦前動(dòng)脈近端、左側(cè)鎖骨內(nèi)動(dòng)脈閉塞處持續(xù)放置微型動(dòng)脈夾來(lái)完成的。血管夾閉持續(xù)1 ～2 h,然后取出夾子以便再灌注[7,15,21,23]。

由于該模型制備過(guò)程中已經(jīng)開顱,因此可以連接冷熱交換器進(jìn)行局部低溫,通過(guò)熱交換等放實(shí)現(xiàn)局部快速降溫。同時(shí),也可以給予該模型全身低溫方法,觀察低溫(深度、持續(xù)時(shí)間、延遲)等因素對(duì)明確血管再通情況下的神經(jīng)保護(hù)作用[15]。另外,由于該方法已經(jīng)開顱操作,不建議再進(jìn)行血管內(nèi)低溫或介入手術(shù)引導(dǎo)的局部低溫,降低低溫方法對(duì)于模型的影響以及重復(fù)手術(shù)對(duì)動(dòng)物造成二次傷害。

2.3 血管內(nèi)介入方法制備腦缺血模型

運(yùn)用血管內(nèi)介入的方法進(jìn)行造模手術(shù),將導(dǎo)管由股動(dòng)脈以介入方法放入MCA 分支,阻斷血流2～3 h。栓子可以選用球囊、血栓,血栓模型梗死后使用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓并給予自體血低溫或血管內(nèi)低溫干預(yù)[8,24-26]。此方法接近臨床,基本模擬了臨床上血栓梗塞,但是缺點(diǎn)在于:血栓位置很難控制,梗死位置不固定,或者血栓有自溶現(xiàn)象[24]。

由于該方法已經(jīng)采用介入方法,因此非常適合進(jìn)行自體血低溫或局部微導(dǎo)管介導(dǎo)的低溫干預(yù)方法。這兩種方法均可以通過(guò)控制液體流速和流量的方法實(shí)現(xiàn)低溫的準(zhǔn)確調(diào)節(jié)[15]。我們團(tuán)隊(duì)近期研究顯示,通過(guò)微導(dǎo)管局部注射低溫鹽水,可能實(shí)現(xiàn)局部低溫,對(duì)恒河猴局部腦缺血模型具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用,同時(shí)并未影響動(dòng)物模型的重要生理指標(biāo)[8]。

3 動(dòng)物倫理問(wèn)題

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究應(yīng)遵守“減少”、“替代”、“優(yōu)化”(Reduce,Replace,Refinement,3R)原則,動(dòng)用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物之前應(yīng)該先經(jīng)過(guò)其他基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,例如:細(xì)胞→嚙齒類動(dòng)物→比格犬→非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,以達(dá)到盡量減少非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的使用,尊重動(dòng)物生命、減少浪費(fèi)。在手術(shù)過(guò)程及術(shù)后治療過(guò)程中選擇恰當(dāng)?shù)穆樽矸绞?減少動(dòng)物痛苦程度。

以各種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦缺血模型為基礎(chǔ)。相信可以在科研與臨床之間起到良好的轉(zhuǎn)化功能。有重大的研究意義。因此可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要運(yùn)用不同的腦缺血模型模擬不同的臨床情況,建立重復(fù)性好、死亡率低、容易控制、梗死面積相對(duì)均一的模型以滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>