楊 鵬 孫 瑩 王志宏 鄭源強 陳國江④ 石艷春內蒙古醫(yī)科大學內蒙古自治區(qū)分子生物學重點實驗室呼和浩特010058

癌癥具有高度異質性,隨著腫瘤的發(fā)展它會變成由多種細胞組成的復雜“器官”。腫瘤細胞和非腫瘤細胞之間的相互作用形成腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)。TME是由腫瘤局部的細胞和非細胞成分組成。在細胞成分中,除了腫瘤細胞外,還有基質細胞,內皮細胞和其他血管細胞以及各種類型的免疫和炎癥細胞組成[1]。在能量代謝失調,血液灌注不足和增殖失控的情況下,TME的非細胞組成不同于正常組織,TME中的特征包括酸化,缺氧,血糖濃度降低和分泌蛋白質的變化[2]。TME在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移、復發(fā)和耐藥中起著不可或缺的作用。腫瘤浸潤的免疫細胞代表一把雙刃劍,因為它們可以支持或抑制腫瘤的生長。利用好免疫細胞,對于治療腫瘤有著重要的意義。

1 TME與酸化

腫瘤酸性微環(huán)境,從本質上來說是腫瘤細胞的異常代謝作用下的結果之一,同時也是免疫抑制微環(huán)境的關鍵因素[3]。實體瘤的顯著特征是存在酸性的TME,這是由于生長中的腫瘤細胞具有獨特的代謝現(xiàn)象,使它們能夠通過有氧糖酵解優(yōu)先利用葡萄糖,這被稱為“Warburg效應”[4]。葡萄糖被代謝為乳酸,后者通過單羧酸鹽將轉運蛋白(monocarboxylate transporters,MCTs),MCT-1和MCT-4與質子共同轉運,從腫瘤細胞中輸出,導致乳酸積累,降低了TME的pH從而造成大量乳酸堆積,引起TME pH降低[5]。此外,TME中乳酸濃度的增加對某些腫瘤是有利的,因為乳酸可以轉化為丙酮酸,從而為三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)提供動力。因此,可以為異質性腫瘤中的鄰近細胞提供燃料,同時抑制免疫反應[6-7]。除乳酸外,由氧化代謝產生的CO2水平升高也是腫瘤酸性的另一主要來源,CO2在缺氧條件下通過TCA循環(huán)和戊糖磷酸途徑產生,可通過碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)被水合,并轉換成HCO3-和H+,碳酸氫鹽將轉運蛋白HCO3-轉運回腫瘤細胞內,細胞外H+濃度升高,pH下降。生長中的腫瘤細胞還有一個重要的特征,就是低氧。缺氧信號傳導的關鍵介質是缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)[8]。缺氧會激活HIF途徑,進而上調葡萄糖轉運蛋白和CA-IX,導致腫瘤酸化的進一步加重低氧也可以上調MCTs,促進微環(huán)境的酸化[9-10]。

因此,從微酸環(huán)境的形成來看,導致酸化的化學成分是不同的,一種是乳酸性酸化,另外一種是碳酸性酸化。TME的酸化,對于免疫細胞的影響機制,也存在乳酸與單獨酸化(提高H+濃度)的區(qū)別。

2 免疫細胞對p H的感知

目前研究認為,免疫細胞可以通過細胞表面的pH敏感型受體去識別和響應細胞外的H+[11]。免疫細胞廣泛表達G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs),包括GPR68(OGR1),GPR65(TDAG8),GPR4和GPR132(G2A)。它們可作為溶脂蛋白的受體,可通過細胞外結構域中的組氨酸殘基(PH6.4～6.8)的咪唑側鏈的質子化來激活。這些受體由不同的信號傳導機制來介導,主要有PLC/Ca2+信號傳導通路,腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase)的刺激介導的cAMP合成與累積和蛋白激酶A/ERK介導的信號傳導通路[12-14]。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)代表了第二組被質子激活的受體[15]。它們是涉及疼痛知覺,缺血性中風,機械感覺,學習和記憶的陽離子選擇性離子通道。ASICs主要包括在周圍感覺和中樞神經系統(tǒng)神經元中表達的六個同工型(ASIC1a,ASIC1b,ASIC2a,ASIC2b,ASIC3和ASIC4)免疫細胞中ASIC的表達尚未明確定義[16]。有研究顯示,這些受體在單核細胞,巨噬細胞和樹突狀細胞中表達[17-19]。質子受體的第三個家族包括瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)[20]。其最初與感覺神經元相關聯(lián),TRPV1已經證實在免疫細胞中表達,被發(fā)現(xiàn)在先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)的細胞中表達,包括巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞及NK細胞[21]。TRPV1在免疫細胞中,既參與鈣信號傳導,又參與外部刺激(例如溫度或pH)的傳導。Ca2+作為第二信使,其在免疫細胞中的活化,分化,增殖,細胞因子分泌和效應功能起到一定的作用[22]。還有一組重要的受體是MCTs,已經報道了MCT-1,MCT-2和MCT-4在免疫細胞中的表達,包括人粒細胞,淋巴細胞和單核細胞[23]。

總的來說,當免疫細胞處于低pH環(huán)境時,抗腫瘤效應細胞(如T細胞和NK細胞)趨于功能喪失,并經歷可逆的無反應狀態(tài),隨后發(fā)生凋亡。相反,免疫抑制成分,例如腫瘤相關巨噬細胞,髓樣來源抑制細胞和調節(jié)性T細胞通過腫瘤酸度參與并維持腫瘤生長,同時阻斷抗腫瘤免疫反應[24]。

2.1 樹突狀細胞 樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)在腫瘤免疫中,主要發(fā)揮抗腫瘤作用[25]。DCs的成熟代表了生命周期中的關鍵一步,使它們獲得了完整的抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APC)功能。當通過模式受體(pattern recognition receptors,PRR)與危險相關的分子模式(dangerassociated molecular patterns,DAMP)時,將啟動成熟,其中不同的DC亞組表達不同的PRR,從而進一步促進了其功能水平。一旦成熟,DCs上調它們的抗原呈遞和共刺激分子,轉化自己變成有效的T細胞激活劑,因此連接先天和適應性免疫[26]。

有一項關于癌癥免疫逃逸機制的研究表明,在多細胞腫瘤球體中存在IL-4和GM-CSF的情況下培養(yǎng)的單核細胞不會獲得CD1a表達(單核細胞衍生DC的標志物),并降低產生IL-12的能力。已證明這些免疫抑制作用是由腫瘤細胞產生乳酸誘導的,而不是HCl。在乳酸濃度大于10 mmol/L時,將pH調至中性,只能部分恢復功能,可能還涉及與MCT-1轉運系統(tǒng)無關的其他機制[27]。最近有研究證明,乳酸強烈抑制CD1a+DC的分化。在中性pH下,乳酸鹽降低CD1a+CD14-DC分化的抑制作用,而IL-12仍然受抑制。單獨的pH改變影響分化標志物或細胞因子的表達水平。因此,乳酸和低pH值一起存在時會提供有效的DC調節(jié)信號,這可能是MCT作用的結果[28]。已有研究證明ASICs參與了酸化誘導的DC成熟[29]。

2.2 腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM) TAM是TME的重要組成部分,能夠促進癌癥進展。TME中過量乳酸的酸化作用會增加巨噬細胞中的精氨酸酶I(arginase I,ARG1)表達,從而抑制T細胞的增殖和活化。二氯乙酸鹽(dichloroacetate,DCA)是一種丙酮酸脫氫酶激酶的抑制劑,可靶向抑制巨噬細胞產生ARG1。乳酸預處理的巨噬細胞抑制CD8+T細胞增殖,但用乳酸和DCA預處理巨噬細胞后,CD8+T細胞增殖得以恢復[30]。TNFα和豆蔻佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate,PMA)誘導了原代人單核細胞和人急性單核細胞白血病停代細胞(mono mac6,MM6)細胞系中OGR1(GPR68)的表達[31]。已經有研究證明,乳酸激活巨噬細胞表面的Gpr132(G2A)受體,促進巨噬細胞的M2極化。并且證明敲除荷瘤小鼠GPR132基因后,乳腺癌轉移被抑制。該研究還表明,是乳酸而不是H+激發(fā)了上述的效應[32]。乳酸通過ERK/STAT3通路驅動巨噬細胞M2極化以促進乳腺癌的增殖,遷移和血管生成[33]。對于酸性pH調節(jié)巨噬細胞的極化作用,最近研究表明,是由GPCR和cAMP介導,已證明由腫瘤酸化誘導的GPCR信號的激活可增加轉錄因子誘導的cAMP早期阻遏物(incducible cAMP early repressor,ICER)的表達,反過來刺激巨噬細胞向非炎癥M2表型極化,從而促進體內腫瘤成長[34]。乳酸通過極化M2巨噬細胞,一方面抑制了浸潤在腫瘤環(huán)境的抗腫瘤效應細胞,另一方面增強腫瘤的增殖,遷移和侵襲。

2.3 NK細胞(natural killer cells,NK) NK細胞在抗腫瘤免疫中起著重要作用。人們普遍認為TME的酸化會抑制NK細胞的抗腫瘤活性。已發(fā)現(xiàn)乳酸和低pH值會降低NK細胞的細胞毒性,乳酸處理的NK細胞表面NKp46的表達降低。并且證明腫瘤來源的乳酸可直接抑制NK細胞功能,也可以通過增加抑制NK細胞毒性的髓樣來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)數(shù)量來間接抑制NK細胞功能[35]。在C57BL/6小鼠中,乳酸抑制NK細胞IFN-γ和顆粒酶B的產生[36]。在PMA/Ionomycin刺激下,NK細胞暴露于乳酸可阻斷其IFN-γ的產生,研究還表明,鼠NK細胞攝取乳酸會導致細胞內酸化和能量代謝受損[36]。在大腸癌肝轉移的腫瘤中發(fā)現(xiàn),浸潤的NK細胞數(shù)量明顯減少,并且驗證了NK細胞的凋亡。在用乳酸處理NK細胞時,TME中的乳酸引起pH依賴性線粒體應激和代謝功能障礙,從而促進細胞凋亡。由于MCT的阻斷沒有改善NK細胞凋亡,因此乳酸的作用可能只與TME的pH有關[37]。

2.4 T細胞 浸潤在TME的T細胞在控制腫瘤發(fā)展中起積極作用,也有調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)促進免疫抑制。已經有體外實驗證明,乳酸對人細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表現(xiàn)出較強的抑制作用,細胞因子(IL-2和IFN-γ),細胞毒性(顆粒酶B和穿孔素的分泌)和細胞增殖均被明顯抑制,并且pH恢復后CTL功能恢復。值得注意的是,單獨加乳酸鹽沒有影響,HCl可以輕度抑制細胞因子的分泌。還有一點,此研究中T細胞培養(yǎng)基pH降低后的胞內pH也降低,可能與MCT有關[38]。最近有實驗表明,用乳酸處理CTL后,TCR觸發(fā)JNK,c-Jun,p38和NFAT的磷酸化受阻,導致CTL功能抑制[36,39]。抗CD3抗CD28刺激的小鼠脾細胞,表面受體TDAG8激活后,IL-2的產生受到抑制[40]。在pH 6.5的酸性環(huán)境中,黑色素瘤患者的腫瘤浸潤T細胞反應性下降,TCR成分(如CD3ζ鏈)的表達降低,IL-2,TNF-α和IFN-γ的分泌受損,當pH恢復時T細胞狀態(tài)逆轉[41]。目前有研究表明,小鼠T細胞外pH降低,對細胞內pH沒有影響,并且證明T細胞表達ASIC3,ASIC4OGR1和TDAG8。研究還顯示,IFN-γ的調節(jié),可能受TDAG8介導的cAMP通路調控,但是單獨敲除TDAG8并不能緩解pH降低帶來的抑制。目前還需要對該受體和其他酸敏感受體進行研究,以確定單獨抑制或聯(lián)合抑制是否可有效緩解pH降低下的表型[42]。根據對之前研究的總結,乳酸可能是主要的影響因素。最近有研究指出,阻斷T細胞的MCT,不會影響T細胞的功能[43]。這為MCT抑制劑的使用,提供了依據。當然也有一種觀點,高濃度的乳酸和H+阻斷T細胞的MCT,影響T細胞的糖酵解,進而影響TCR的激活[44]。對于乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的抑制,也有報道,CD4+T細胞中LDHA抑制會導致IFN-γ產生出現(xiàn)缺陷[45]。LDHA負責將丙酮酸轉化為乳酸,在腫瘤細胞中高度表達,雖然抑制LDHA可以降低乳酸濃度,但是對T細胞效能有影響。

另一方面腫瘤相關的成纖維細胞(cancerassociated fibroblasts,CAFs)產生的乳酸通過SIRT1介導的T-bet降解,降低抗腫瘤Th1亞型的百分比。并通過在前列腺癌模型中促進FoxP3激活來刺激Treg增殖,誘導免疫抑制環(huán)境[46]。

3 靶向腫瘤酸性微環(huán)境以改善癌癥免疫治療

腫瘤酸性微環(huán)境抑制T細胞和NK細胞功能,從而抑制腫瘤免疫監(jiān)測。因此可以控制TME酸度從而校正T細胞功能障礙和增強T細胞效能。目前,主要有兩種降低TME pH的方法,一種是單獨降低H+的濃度,另外一種是降低乳酸的濃度。單獨降低H+是比較直接的方法,通過中和H+,使用質子泵抑制劑,抑制質子轉運和碳酸酐酶[42,47-48]。而降低乳酸濃度的方法則有多種,比如①通過敲除腫瘤細胞糖酵解基因,抑制糖酵解源頭；②通過阻斷乳酸轉運蛋白MCT1和MCT4,阻止乳酸向腫瘤細胞外轉運[43]。最近有研究顯示,限制腫瘤細胞糖酵解既保留了T細胞的效應功能,又增強了檢查點療法[43]。因此聯(lián)合其他免疫療法,可能是更有前景的策略。針對實體瘤的CAR-T(chimeric antigen receptor T cells)和CAR-NK(chimeric antigen receptor NK cells)技術,目前面臨著免疫抑制的困境[49-50]。在此技術之上,增加腫瘤浸潤的T細胞的數(shù)量和提高抵抗酸性微環(huán)境的能力,是未來改善CAR-T/CAR-NK治療實體瘤療效的策略之一。

GPCRs中的OGR1(GPR68)在多種免疫細胞中表達,特別是在巨噬細胞和T細胞中的大量表達。因此,GPR68信號傳導可能會影響腫瘤中的免疫細胞功能。GPR68可能是未來腫瘤治療重要的靶點[51]。

4 總結

總之,主要通過體外實驗分析低pH對免疫細胞功能的影響。一些矛盾的結果主要反映出降低培養(yǎng)基pH值的不同方法,一些研究使用了HCl的等滲溶液,但另一些研究則使用了乳酸。因此,通過使用HCl或乳酸來改變培養(yǎng)基的pH來發(fā)現(xiàn)不同的觀察結果并不意外。那些同時研究了這兩種化合物的研究都支持低pH值本身會發(fā)揮主要的免疫調節(jié)作用,進一步支持了乳酸介導的觀點。目前為止,腫瘤酸性微環(huán)境對免疫細胞造成的影響已經明晰,但是其受到酸化抑制的機制還需要繼續(xù)研究。