安田麗 李亮亮 趙 麗 蘭州大學第一醫(yī)院血液科蘭州730000

骨髓微環(huán)境由多種造血細胞、非造血細胞、胞外基質(zhì)和其他信號蛋白組成,可為造血干細胞提供與分化、凋亡等刺激信號隔離的屏障,還可阻止干細胞過度增殖,防止腫瘤發(fā)生。骨髓微環(huán)境一旦發(fā)生紊亂,對血液惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展將產(chǎn)生重要影響。研究表明,白血病患者骨髓微環(huán)境免疫應答有助于白血病干細胞擴增,促進白血病發(fā)展[1]。血液系統(tǒng)腫瘤患者骨髓微環(huán)境中聚集較多的免疫抑制細胞,其中以CD4+CD25+CD127low/-表型為特征的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)具有獨特的免疫抑制作用,通過抑制微環(huán)境引發(fā)腫瘤免疫逃逸,與血液腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。急性白血病、多發(fā)性骨髓瘤等血液腫瘤患者骨髓中Tregs水平增高,且與腫瘤進展及預后呈負相關(guān)[2-6]。抑制Tregs是腫瘤免疫療法的方向之一,因此多種化療藥物、疫苗、免疫檢查點抑制劑等應用與臨床,但仍具有一定局限性。研究發(fā)現(xiàn),血液惡性腫瘤,骨髓微環(huán)境中一些因素可增加Tregs免疫抑制功能,阻礙靶向Tregs的免疫治療,進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。據(jù)報道,轉(zhuǎn)錄因子(Helios)、衰老基因(miRNA、SENEX)、長非編碼(lnc)RNA胰島素受體前體長非編碼RNA胰島素受體前體(long noncoding RNA lnc-insulin receptor precursor,INSR)、T細胞共刺激分子配體(ICOSL)、增殖誘導配體(APRIL)、IL-33、IL-35、TGF-β、IL-2、IL-10、VEGF、IL-17、間充質(zhì)干細胞、樹突狀細胞、趨化因子CCL22、CXCL12等可促進Tregs的免疫抑制功能,從誘導Tregs分化、擴增、存活及遷移等方面影響Tregs功能,通過抑制或阻斷以上促進因素可逆轉(zhuǎn)Tregs的免疫抑制功能。因此,闡明影響Tregs的多種因素及其作用機制可為血液惡性腫瘤以Tregs為靶標的免疫療法提供新思路。

1 基因?qū)regs的影響

1.1 lnc-INSR通過增強Tregs分化促進免疫抑制lncRNA于大部分人類基因組轉(zhuǎn)錄,并通過轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄中或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用在人類癌癥和先天性疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。WANG等[2]采用高通量轉(zhuǎn)錄組篩選提取兒童急性T淋巴細胞白血病患者骨髓中CD4+T細胞,并分析lncRNA在與白血病相關(guān)免疫微環(huán)境中的潛在功能和機制,證明了與免疫抑制相關(guān)的lnc-INSR在急性淋巴細胞白血病患者中增加,同時定位于細胞膜和細胞質(zhì)的lnc-INSR促進Tregs分布并降低細胞毒性T淋巴細胞水平導致腫瘤生長。

通過與INSR直接結(jié)合,lnc-INSR阻斷了INSR泛素化位點,導致INSR和PI3K/AKT信號通路異常激活從而誘導抑制性免疫微環(huán)境,在白血病微環(huán)境中誘導腫病侵襲。PI3K相關(guān)信號傳導途徑缺失損傷Tregs活化,抑制PI3K/AKT信號可抑制Tregs產(chǎn)生。在T細胞調(diào)節(jié)期間,T細胞受體信號通過PI3K/AKT控制Foxp3表達,表明該信號傳導網(wǎng)絡可調(diào)節(jié)CD4+T細胞中Foxp3表達[8]。進一步表明lnc-INSR通過增強Tregs分化促進免疫抑制。

白血病患者免疫功能存在缺陷,原因為可溶性因子和免疫檢測點分子激活免疫抑制通路,Tregs抑制抗腫瘤免疫細胞功能,從而促進癌癥進展。因此lncRNA可能成為與兒童T-ALL相關(guān)的免疫微環(huán)境有效治療靶標。

1.2 miRNA調(diào)節(jié)Tregs增殖 miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA,由20～25個核苷酸組成,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA表達。研究發(fā)現(xiàn),胸腺細胞中miRNA缺乏導致胸腺、脾、淋巴結(jié)中Tregs數(shù)減少[9]。Dicer、Drosha是miRNA產(chǎn)生過程中重要的酶,通過建立Tregs Dicer或Drosha缺失小鼠模型,發(fā)現(xiàn)小鼠均出現(xiàn)致死性早發(fā)性淋巴細胞增多癥,表明無論是去除Dicer還是Drosha,Foxp3表達均受到抑制。Tregs所釋放的抑制分子、誘導基因、顆粒蛋白酶B(GzmB)分泌減少,導致Tregs抑制功能明顯下降。因此miRNA是影響Tregs發(fā)揮正常生理功能的重要因素[10]。有多種miRNA被提出與Tregs增殖、生長及功能有關(guān),其中在Tregs中高表達的有miR-155、miR-146a、miR-10a、miR-95等,低表達的有miR-20、miR-19a/b、miR-106b、miR-24、miR-145等,這些miRNA對Tregs的影響及調(diào)節(jié)機制仍處于探索階段。在血液腫瘤及其他實體腫瘤中,深入研究miRNA對Tregs的免疫抑制功能對免疫治療開發(fā)具有重要作用。

1.3 SENEX保護Tregs發(fā)揮免疫抑制效應 衰老基因SENEX位于4號染色體長臂(4q31.23),全長2 901 bp,編碼含663個氨基酸殘基、分子量約75 kD的蛋白,SENEX編碼的蛋白在細胞信號轉(zhuǎn)導通路中起重要作用,主要調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、遷移、黏附、吞噬和細胞生長發(fā)育等,并通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄控制細胞生長周期、衰老和凋亡[11]。pRb和p53通路是其最重要的2個中央控制節(jié)點,決定細胞增殖還是活化衰老和凋亡。衰老基因SENEX誘導的應力性衰老(stress induced premature senescence,SIPS)具有抗凋亡和免疫抑制效應。研究發(fā)現(xiàn),SENEX基因可能通過活化p16INK4A/Rb途徑誘導SIPS保護Tregs[12-13]。而Tregs又是誘導AML細胞逃逸機體抗腫瘤免疫應答的關(guān)鍵因素[14]；采用RT-PCR檢測AML不同階段SENEX基因的表達,結(jié)果顯示,在初診AML患者骨髓中SENEX基因表達顯著增高,完全緩解后表達降低,復發(fā)時再度升高,提示SENEX基因保護Tregs與AML發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。推測衰老基因SENEX是促進AML免疫逃逸的機制之一,但SENEX信號通路在AML中的具體作用機制有待進一步研究。

2 細胞因子對Tregs的影響

2.1 ICOSL的表達直接誘導Tregs擴增 Tregs依賴于細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導T細胞受體、共刺激分子和細胞因子的刺激發(fā)揮免疫抑制作用。誘導型T細胞共刺激分子(inducible T-cell costimulator,ICOS)為CD28共刺激分子家族 成員,與ICOS配體(inducible T-cell costimulator ligand,ICOSL)結(jié)合維持持久的免疫反應。腫瘤組織中的Tregs在其表面表達ICOS,ICOS/ICOSL軸在Tregs功能發(fā)揮中起關(guān)鍵作用,并通過激活磷酸肌醇3-激酶/AKT途徑促進Tregs分化[15]。ICOS共刺激CD4+T細胞有利于促進Th2細胞因子,如IL-4、IL-10和IL-13[16]。

HAN等[3]發(fā)現(xiàn)AML患者骨髓中存在高水平的ICOS+Tregs,在腫瘤微環(huán)境中具有高度活性。AML細胞上的ICOSL Tregs增殖并刺激其產(chǎn)生可溶性細胞因子,如通過IL-10損傷抗原遞呈細胞而間接抑制T細胞應答[17]。通過與過表達ICOSL的AML細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+ICOS+T細胞比CD4+CD25+ICOS-T細胞具有更強的分泌IL-10能力,進一步促進AML細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn),ICOSL高表達患者比ICOSL低表達的AML患者無病生存期短。采用抗ICOSL抗體阻斷ICOS信號傳導,損害了Tregs的產(chǎn)生并且延遲了注射C1498細胞的AML小鼠疾病進展。采用阻斷性抗ICOSL mAb阻斷ICOS信號傳導可影響Tregs和腫瘤細胞的相互作用并延緩疾病進展[3]。

體內(nèi)阻斷ICOSL可減少腫瘤環(huán)境中的Tregs,需要仔細分析ICOS共刺激阻斷對Tregs與效應T細胞的作用。AML細胞的ICOSL表達可能直接驅(qū)動Tregs擴增作為免疫逃避的機制,且ICOS+Tregs是AML患者更好的預后預測因子。抑制ICOS表達或阻斷ICOS共刺激信號傳導可能具有治療前景,可能成為AML的特異性靶向治療策略。

2.2 APRIL通過TACI刺激Tregs增殖和存活 增殖誘導配體(A proliferation-inducing ligand,APRIL)是惡性漿細胞生長和存活的關(guān)鍵因子,是B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)和穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor,TACI)的天然高親和力配體[18-19]。APRIL/BCMA信號傳導促進多發(fā)性骨髓瘤(MM)進展和誘導MM細胞免疫抑制因子生成[20]。最近通過新型免疫療法靶向抑制BCMA已在復發(fā)和難治性MM治療中取得重要進展。

TAI等[5]通過上調(diào)Tregs標記(Foxp3、CTLA-4)證實了APRIL受體TACI在Tregs中的表達顯著高于同一患者的常規(guī)T細胞(Tcons)。從47例MM患者的外周血或骨髓抽吸物中新鮮分離的T細胞中,CD4+(和CD8+)CD25highT細胞的TACI表達比CD4+(和CD8+)CD25lowT細胞高3～5倍。在CD4+(和CD8+)CD25lowT細胞上也觀察到比CD4+(和CD8+)CD25-Tcons表達更高的TACI。APRIL缺陷小鼠的MM細胞生長明顯減少,表明APRIL可加快MM進展。破骨細胞是MM骨髓中APRIL和PD-L1產(chǎn)生的關(guān)鍵來源,在多發(fā)性骨髓瘤中,與TACI結(jié)合的APRIL信號通過Foxp3、IL-10、TGF-β、PD-L1、CD15等免疫抑制分子顯著促進Tregs和調(diào)節(jié)B細胞(regulatory B cells,Bregs)增殖、存活和免疫抑制功能,從而增強Tregs對Tcons的抑制作用,使Tregs成為介導破骨細胞抑制免疫的關(guān)鍵細胞[6]。相反,單獨采用拮抗性抗APRIL mAb或與PD1/PD-L1檢查點抑制劑聯(lián)用阻斷APRIL-TACI軸可下調(diào)免疫調(diào)節(jié)細胞表達,減輕骨髓微環(huán)境抑制。

采用抗APRIL(單獨或與抑制劑PD1/PD-L1)靶向APRIL/TACI軸進一步調(diào)節(jié)Tregs和Bregs可改善免疫抑制,恢復免疫,并改善MM患者預后,提供了靶向APRIL以克服免疫抑制、改善患者治療結(jié)果的新方法。

2.3 IL-33誘導Tregs分化或擴增 IL-33調(diào)節(jié)各種免疫細胞群,不僅誘導輔助性T細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞產(chǎn)生2型細胞因子,也可調(diào)節(jié)巨噬細胞、樹突狀細胞、Th1、NK,包括某些病理生理條件下的NK T和CD8 T細胞、髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和Tregs。

MDSCs是異質(zhì)免疫細胞群,包括骨髓祖細胞和未成熟的骨髓細胞,具有強大的免疫抑制作用,未成熟的骨髓細胞在骨髓中產(chǎn)生并迅速分化成巨噬細胞,樹突狀細胞或粒細胞。而病理環(huán)境阻止未成熟骨髓的正常分化,促進其積累和誘導其抑制功能。小鼠MDSCs的特征在于共表達CD11b和GR1,分為2個亞組:粒細胞MDSCs(G-MDSCs)具有CD11b+Ly6G+Ly6C～表型和單核細胞MDSC(MMDSCs)具有CD11b+Ly6G Ly6Chigh表型通過不同的信號傳導途徑抑制T細胞增殖和活化[21]。

HUI等[21]將IL-33處理或未處理的MDSCs與不同比例(1∶2、1∶4和1∶8)且同時存在抗CD3/CD28抗體的CD4+T細胞共培養(yǎng)3天,通過流式細胞術(shù)測定CD25+FOXP3+Treg細胞,以缺乏MDSCs但含有抗CD3/CD28抗體培養(yǎng)的T細胞作為陽性對照。與對照組相比,IL-33處理的MDSCs在所有實驗中誘導較少的Tregs增長,表明IL-33降低MDSCs的抑制T細胞能力,誘導Tregs分化或擴增。靶向IL-33有望降低腫瘤微環(huán)境中Tregs的抑制功能。

2.4 IL-35促進Treg細胞免疫抑制作用 Tregs誘導AML細胞免疫逃逸的機制較為復雜,除已知的細胞因子IL-10和TGF-β外,IL-35與Tregs關(guān)系密切。IL-35是抑制性細胞因子,主要由活化的Tregs分泌。此外胎盤滋養(yǎng)層細胞、活化的樹突狀細胞和巨噬細胞也可產(chǎn)生IL-35。IL-35可誘導初始T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻庖咭种谱饔玫恼{(diào)節(jié)性T細胞(iTr35),形成“傳染性耐受”,將抑制活性最大化。由于IL-35的免疫抑制作用,可以認為其能夠促進腫瘤進展。研究表明,IL-35在多種實體腫瘤(如胰腺癌、大腸癌、非小細胞肺癌)和血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如急性髓系白血病)患者的腫瘤組織或外周血中表達水平增高[22]。

通過檢測AML不同階段IL-35蛋白表達,發(fā)現(xiàn)在初診AML患者骨髓中IL-35蛋白的表達顯著增高,完全緩解后表達降低,復發(fā)時再度升高,提示IL-35與AML發(fā)展密切相關(guān)。再次對FCM分選的患者骨髓中AML原始細胞進行培養(yǎng)和干預,通過對IL-35刺激的AML細胞增殖情況進行分析,發(fā)現(xiàn)IL-35顯著上調(diào)AML細胞中IL-35R表達,同時顯著促進AML細胞增殖,而凋亡實驗也發(fā)現(xiàn)IL-35預刺激的AML細胞可顯著抵抗阿糖胞苷(Ara-C)誘導的凋亡。表明IL-35可通過與其受體結(jié)合作用于AML細胞,并顯著促進AML細胞增殖,抑制AML細胞凋亡[23]。因此IL-35有望成為影響Tregs的重要靶點。進一步研究IL-35與Tregs關(guān)系對血液腫瘤具有重要意義,有望成為靶向治療新方法。

2.5 TGF-β、IL-2促進Tregs分化 Tregs分化依賴于特定細胞因子刺激,其中對細胞因子TGF-β和IL-2的研究最為透徹。TGF-β與Tregs分化和功能密切相關(guān),TGF-β通過其受體復合物將信號轉(zhuǎn)導至果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白2(srosophila mothers against deeapentaplegie protein2,Smad2)和Smad3,Smad2和Smad3磷酸化后結(jié)合Smad4,并共同移位入核,結(jié)合于DNA上的Smad結(jié)合位點(啟動子區(qū)),調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄[24]。此外,TGF-β也通過表觀遺傳學方式促進Foxp3基因調(diào)控區(qū)去甲基化,使Foxp3更易于表達。LI等[25]研究發(fā)現(xiàn),甲硫氨酸腦啡肽(methionine enkephalin,MENK)通過影響TGFβ生成有效抑制Foxp3表達,最終抑制初始CD4+CD25-T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Tregs。此外Tregs可產(chǎn)生高水平TGF-β,削弱CD8+T細胞和NK對腫瘤細胞的殺傷作用。MM患者體內(nèi)的樹突狀細胞功能異常,在體內(nèi)可誘導產(chǎn)生多種高水平細胞因子,如VEGF、IL-10等,與TGF-β和Tregs存在一定聯(lián)系,經(jīng)相互協(xié)調(diào)發(fā)揮免疫抑制效應[25]。

IL-2是人體免疫調(diào)節(jié)體系中最重要的淋巴因子,可刺激局部或全身的免疫應答,是惡性腫瘤生物免疫治療的常用制劑之一。IL-2也是輔助性T細胞中Th1細胞因子之一,主要參與細胞免疫。Tregs的體內(nèi)平衡主要依賴于IL-2介導的信號通路。當人或動物體內(nèi)缺乏IL-2或其受體α鏈/CD25及β鏈/CD122時,Tregs數(shù)減少。nTreg由于本身不分泌IL-2,主要依靠旁分泌IL-2,通過IL-2Rαβγ三聚體發(fā)揮對調(diào)節(jié)性T細胞 的調(diào)節(jié)功能[26]。敲除小鼠IL-2受體可影響其體內(nèi)Tregs功能,使其數(shù)量減少。IL-2也能通過信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子5(signal transduction and activator of transcription5,STATS)磷酸化誘導成熟Tregs分化,STAT5持續(xù)激活對Tregs胸腺分化具有促進作用[27-28]。IL-2異常表達與急性髓性白血病患者的腫瘤細胞逃避密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)AML初診患者外周血IL-2顯著降低,治療后IL-2明顯升高。通過 阻斷IL-2R有效遏制移植排斥反應和自身免疫性疾病,同時可用于HIV患者、癌癥患者、急性骨髓性淋巴瘤患者治療[29]。IL-2還可為Tregs代謝提供能量,發(fā)揮免疫抑制功能。臨床上通過靶向IL-2/IL-2R相互作用可重新評估Tregs在人類疾病治療上的戰(zhàn)略意義。

2.6 IL-10介導Tregs參與免疫逃逸 IL-10主要由單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞分泌,故其在淋巴結(jié)及扁桃體相關(guān)部位均有表達。IL-10具有多效性生物學活性,對機體免疫活性和炎癥過程具有重要調(diào)節(jié)作用。IL-10可抑制T淋巴細胞激活及其細胞因子尤其是Th1細胞因子(如IL-2、IFN-γ)分泌,誘導T淋巴細胞免疫耐受,抑制抗體依賴性T淋巴細胞增生。IL-10既是腫瘤生長因子又是免疫抑制因子,不同時期的研究表明,Tregs可在IL-10介導下阻止樹突狀細胞成熟及抗原遞呈作用和抑制殺傷性T細胞增殖與活化,起到免疫耐受與逃逸的作用[30]。通過檢測骨髓微環(huán)境中化療前后Tregs、IL-10變化,表明在AML患者的骨髓微環(huán)境中累積的Tregs通過IL-10介導強烈的免疫抑制作用,化療后骨髓微環(huán)境中血漿IL-10水平明顯降低,表明IL-10可能是一種負面影響因素[30]。

2.7 VEGF趨化Tregs參與免疫逃逸 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種糖基化多肽性分泌因子,為生長因子的家族,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子。由于mRNA剪切方式不同,可產(chǎn)生VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF1 83、VEGF189和VEGF206等蛋白形式。VEGF不僅是重要的促血管生長因子,還可影響多種免疫抑制細胞功能,參與腫瘤免疫逃逸。多項研究證實VEGF對Tregs有趨化作用。在小鼠黑色素瘤模型中,神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP1)在Tregs中高表達,腫瘤細胞自分泌的VEGF作為趨化因子,可引導Tregs浸潤腫瘤組織,從而負向調(diào)控抗腫瘤免疫效應[32]。敲除Tregs表面的NRP1后,腫瘤生長速度下降。研究發(fā)現(xiàn),晚期黑色素瘤患者血清VEGF水平和外周血Tregs擴增具有一定相關(guān)性[33]。VEGF過度表達導致Tregs數(shù)增多,而抑制VEGF與其受體VEGFR結(jié)合可導致Tregs數(shù)減少,從而導致抗腫瘤活性增強。

VEGF與血液系統(tǒng)惡性腫瘤緊密相關(guān),白血病細胞不僅高表達VEGF,且不同程度表達VEGF受體,影響白血病患者預后。采用ELISA方法檢測白血病患者血清VEGF,難治/復發(fā)組與初發(fā)組VEGF水平較緩解組及正常對照組高(P＜0.05)[33]。白血病患者骨髓血管含量較高,骨髓和血清VEGF水平超過正常標準,在新血管幫助下促使病情進一步惡化。而Tregs可通過VEGF增強炎癥T細胞分化功能,抑制樹突狀細胞成熟,減弱對腫瘤的殺傷能力而誘導免疫逃逸。

2.8 IL-17協(xié)同Tregs促進腫瘤進展 Th17細胞是新的CD4 T細胞亞群,分泌即IL-17A,還可分泌IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26等細胞因子,研究表明調(diào)節(jié)性T細胞可被重編程為新的亞群即IL-17+FOXP3+T細胞,是Th17細胞和Tregs的中間分化階段。Tregs和Th17細胞來源于初始T細胞,而IL-17+FOXP3+T細胞起源于Tregs。研究表明,在抗原遞呈細胞和適量促炎因子激活下Tregs可轉(zhuǎn)換為Th17細胞,產(chǎn)生少量IL-17[36]。

IL-17作為一種促炎細胞因子,主要表達惡性腫瘤患者的腫瘤原位血液和腹水中。胰腺癌、子宮頸癌、白血病的臨床研究表明,腫瘤組織和外周血中Th17細胞比例、細胞因子IL-17在血清中的水平明顯高于正常對照組；IL-17在腫瘤組織中的浸潤程度與微血管密度呈正相關(guān)[36-37]。IL-17作用于結(jié)腸癌細胞6 h后,VEGF mRNA含量明顯升高,48 h后,培養(yǎng)上清中VEGF表達顯著高于對照組,提示IL-17促進癌細胞合成和分泌促血管生成因子[38]。

研究發(fā)現(xiàn),初診CLL組患者細胞因子IL-17高于對照組(P＜0.05)[39]。治療后CLL患者血清中IL-17低于初診CLL組(P＜0.05)。在CLL微環(huán)境中,Tregs及Th17細胞及其分泌的細胞因子TGF-β及Th17可互相轉(zhuǎn)化或互相抑制,保持機體對腫瘤抗原的免疫效應和免疫抑制平衡。MM腫瘤微環(huán)境中,機體受腫瘤某種抗原刺激,導致Tregs顯著升高,同時打破Tregs/Th17均衡,促使Th17細胞產(chǎn)生一定水平的IL-17并連同其他相關(guān)細胞因子,共同促進MM患者瘤細胞惡性增殖,形成惡性循環(huán),使機體大部分免疫反應破壞。深入了解Tregs與TGF-β和IL-17的相互關(guān)系及作用機制可能為CLL免疫治療提供新的思路。

3 免疫細胞對Tregs的影響

3.1 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)介導Tregs擴增 MSCs是多能祖細胞,具有分化為骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的潛力。除再生特性外,MSCs還具有顯著的免疫抑制潛力[40]。MSCs不是天然的免疫抑制劑,必須受到刺激或誘導才能發(fā)揮免疫抑制作用,如低氧和炎癥微環(huán)境[41]。KADLE等[42]研究指出,在低氧張力和炎癥微環(huán)境中誘導MSCs將增強免疫抑制潛力,促進干細胞樣特征維持,典型的MSCs表面標志物表達和增殖,維持MSCs分化潛能。向CD4+/同種異體內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)物中添加自體MSCs使Tregs增殖增加,當MSCs在缺氧條件下時,Tregs增殖進一步增強。MSCs介導的Tregs擴增不需要直接接觸。吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)是缺氧和IFN-γ刺激的免疫抑制的關(guān)鍵介質(zhì),當MSCs在缺氧條件下時,IDO(MSCs免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì))表達增加,介導Tregs增殖,并抑制IDO顯著降低Tregs擴增。同時采用炎癥細胞因子IFNγ和TNF-α誘導也增加MSC免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的標志物表達,IDO表達增加。表明MSCs在缺氧或炎癥條件下可有效發(fā)揮免疫抑制功能并介導Tregs擴增,因此靶向MSCs對Tregs的作用在臨床應用中具有重要意義。

3.2 樹突狀細胞通過白三烯B4誘導Tregs增殖樹突狀細胞是引發(fā)適應性免疫應答的關(guān)鍵因素,可感知外周信息并將其傳輸至幼稚T細胞。樹突狀細胞的激活/成熟可以是微生物模式,也可以由危險信號和炎癥等信號觸發(fā)細胞因子和介質(zhì)提高其遷移能力,用于抗原呈遞和激活T細胞。T細胞分化不僅取決于抗原呈遞本身,且取決于通過激活樹突狀細胞時分泌的可溶信號,因此激活期間的微環(huán)境對于樹突狀細胞激活T細胞應答至關(guān)重要[43]。

研究發(fā)現(xiàn)白三烯B4是一種有效的刺激物,是在5-脂氧合酶(5-LO)作用下產(chǎn)生的花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,作用于G蛋白偶聯(lián)受體,包括高親和力受體BLT-1和低親和力受體BLT-2[44]。研究發(fā)現(xiàn),10 mmol/L白三烯B4刺激樹突狀細胞增加高親和力受體BLT-1的基因表達,同時還增加了共刺激分子CD86表達,但不影響CD80和CD40表達[45]。白三烯B4刺激的樹突狀細胞誘導Tregs增殖并增加共培養(yǎng)的Th2細胞因子IL-13表達,同時增加轉(zhuǎn)錄因子基因Gata3和Foxp3(Th2和Tregs)表達。表明白三烯B4影響樹突狀細胞并調(diào)節(jié)適應性免疫應答的類型。用白三烯B4刺激樹突狀細胞促進Tregs分化或增殖,共培養(yǎng)物中FOXP3+Tregs的增加可能與用白三烯B4刺激樹突狀細胞后CD86上調(diào)有關(guān)。因此,進一步研究抑制白三烯B4合成或在疾病模型中阻斷其受體進而調(diào)節(jié)樹突狀細胞可能成為新的治療方法。

4 趨化因子對Tregs的影響

4.1 CCL22募集Helios+Treg促進白血病骨髓微環(huán)境血管生成 Helios是Ikaros家族成員,在淋巴細胞增殖和分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[46]。Helios過表達增強Tregs對Th細胞的免疫抑制功能[47]。LI等[48]通過注入Helios+FOXP3+Tregs至裸鼠體內(nèi),建立了免疫抑制內(nèi)部環(huán)境模型,提高骨髓中白血病細胞浸潤程度,證實Helios+Tregs在血管生成中的關(guān)鍵作用,與白血病發(fā)生密切相關(guān)。相反,腫瘤內(nèi)的Helios缺陷型Tregs則有助于抗腫瘤免疫反應[49]。

Helios+Treg可通過CCL22和VEGFA-VEGFR2途徑促進白血病骨髓微環(huán)境血管生成。LI等Helios在Tregs中高表達刺激巨噬細胞,DCs或白血病細胞分泌CCL22,CCL22通過CCR4募集Tregs至骨髓中,通過VEGFR2激活VEGF信號傳導途徑促進腫瘤部位血管生成,在體外可通過抑制CCR4抑制Tregs遷移[50]。

VEGFR2是血管內(nèi)皮細胞中VEGFR的主要信號傳導因子。VEGF通過VEGFR2刺激腫瘤血管內(nèi)皮細胞生成、增殖和存活,還可通過增加血管通透性和從骨髓募集血管前體細胞促進血管生成[51]。抑制VEGFA/VEGFR2信號轉(zhuǎn)導可減少惡性腫瘤環(huán)境中的Tregs[52]。特異性抗體阻斷VEGFA可減少Tregs數(shù),針對VEGFRs的藥物舒尼替尼可減少荷瘤小鼠和轉(zhuǎn)移性腎癌患者的Tregs數(shù)量[53]。

總之,Tregs可促進趨化因子CCL22分泌,將更多的Tregs募集骨髓。增加的Helios+Tregs通過VEGFA/VEGFR2途徑促進ALL小鼠骨髓血管生成。因此,Helios可能是在臨床中調(diào)控Tregs發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子,解釋了Treg細胞參與ALL發(fā)病的機制,且有助于通過抑制表達Helios Tregs開發(fā)ALL的分子治療策略。

4.2 CXCL12/CXCR4介導Tregs遷移 骨髓基質(zhì)細胞表達功能性趨化因子CXCL12,也稱為基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1),可與其同源配體CXCR4特異性結(jié)合,介導多種免疫細胞轉(zhuǎn)運。骨髓是Tregs重要的儲存庫,CXCL12/CXCR4信號傳導對Tregs在骨髓和外周血之間的運輸至關(guān)重要[50]。CXCL12在骨髓中表達并誘導Tregs黏附和遷移,Tregs通過CXCR4/CXCL12信號途徑保留骨髓。

ZOU等[54]通過給予非肥胖糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷患者靜脈內(nèi)輸注人Tregs 40～60 h后,可見Tregs主要集中于骨髓,而在外周血中能檢測到Tregs＜100個/ml。體內(nèi)給予特定抗人CXCR4單克隆抗體可顯著減少Tregs遷移至骨髓。將人血CD4+CD25+T細胞以100μl注射至雌性小鼠尾靜脈,腹腔注射抗人CXCR4(500 ng/200μl)2次,收集骨髓、血液和脾臟,結(jié)果顯示小鼠骨髓在體外可有效介導人單核細胞衍生的樹突狀細胞(monocyte-derived dendritic cells,MDCs)激活的Tregs以劑量依賴遷移,可顯著被小鼠抗人CXCR4單克隆抗體阻斷。CXCL12/CXCR4信號對Tregs運輸至骨髓至關(guān)重要。最近報道提出,在卵巢癌、間皮瘤及白血病患者中,拮抗CXCR4可減少Tregs,還可促使Tregs向T輔助細胞轉(zhuǎn)化[55-57]。

CXCL12通過募集Tregs進入骨髓代表了Tregs穩(wěn)態(tài)的一種新穎且重要的機制,通過抑制CXCL12/CXCR4信號可阻斷Tregs遷移,可能是逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境并增強抗腫瘤免疫的一種有前景的治療策略。

5 總結(jié)

近年來,血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療雖然取得了一定進展,但多數(shù)患者最終仍會復發(fā)并化療或放療引起的嚴重副作用,研究免疫調(diào)節(jié)細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。免疫細胞是血液腫瘤的重要組成部分,Tregs擴增導致抗腫瘤免疫反應受損從而導致免疫逃逸和血液腫瘤及實體腫瘤進展,而骨髓微環(huán)境對Tregs至關(guān)重要,影響Tregs在腫瘤進展中的作用,加速腫瘤進展。近年對Tregs研究正步入新階段,在腫瘤免疫治療過程中如何提高腫瘤治療特異性以達到最佳治療效果,如何消除Tregs的影響達到最佳治療效果,隨著研究的深入,Tregs在腫瘤免疫治療中最終會得到明確結(jié)論。在精準醫(yī)療背景下,任何與疾病預后相關(guān)的可控性危險因素都應進行預防性干預,深入研究Tregs與骨髓微環(huán)境進行的具體分子調(diào)控機制在免疫治療中具有廣闊前景,有助于探索新的免疫療法,延長患者生存期甚至治愈。