劉 易， 丁 怡， 劉 蓉， 王建枝，3， 柯 丹△， 王小川，3

（1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，湖北武漢430030；2濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，山東濰坊261053；3南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南通226001）

1 創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的概況

TBI 在全球意外傷害的死亡和傷殘?jiān)蛑芯邮孜?，帶?lái)了諸多經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療等社會(huì)問(wèn)題。實(shí)際上，全世界每年有1 000 萬(wàn)人死亡和就醫(yī)直接歸因于TBI，大約有5 700 萬(wàn)人患有腦損傷相關(guān)疾病[1]。TBI 的幸存者會(huì)出現(xiàn)有多種病理現(xiàn)象，例如神經(jīng)功能缺損，短期和長(zhǎng)期腦損傷，認(rèn)知、行為和情感障礙，所有這些都取決于損傷的嚴(yán)重程度。從功能成像研究中可以明顯看出，認(rèn)知方面的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷是由于海馬萎縮和白質(zhì)束受損所致[2]。TBI 可根據(jù)其嚴(yán)重程度和作用機(jī)制進(jìn)行分類(lèi)[3]。在動(dòng)物模型中，通過(guò)復(fù)制輕、中、重度不同程度的TBI，觀察導(dǎo)致其結(jié)果惡化的臨床因素對(duì)于疾病病理和治療的理解至關(guān)重要。

TBI能導(dǎo)致腦腫脹、軸突損傷和缺氧，破壞血腦屏障功能，增加炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)變性，并導(dǎo)致認(rèn)知障礙[4]。盡管許多患者在最初的傷害中幸存了下來(lái)，但TBI 是一種慢性疾病過(guò)程，最終可能導(dǎo)致他們幾個(gè)月甚至幾年后的死亡[5]。TBI后的細(xì)胞死亡是神經(jīng)功能缺損和死亡的主要原因[6]。TBI的發(fā)生是一種初始損傷引起生化和細(xì)胞變化的疾病過(guò)程，這些變化最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的持續(xù)損傷和死亡。這種持續(xù)的損傷被稱為繼發(fā)性損傷，多種凋亡和炎性途徑在這一過(guò)程中被激活[7]。腦損傷后的腦環(huán)境狀態(tài)以及由此產(chǎn)生的繼發(fā)性腦損傷決定了患者最終的結(jié)果。

頭部創(chuàng)傷導(dǎo)致的腦損傷一般分為兩類(lèi)：急性腦損傷包括輕度TBI 或腦震蕩，包括其短期后遺癥和可能導(dǎo)致死亡的災(zāi)難性腦損傷，最常見(jiàn)的原因是硬膜下血腫；慢性腦損傷又稱慢性創(chuàng)傷性腦?。╟hronic traumatic encephalopathy，CTE），是由反復(fù)頭部創(chuàng)傷導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病，多出現(xiàn)在專(zhuān)業(yè)拳擊手和其他接觸性體育運(yùn)動(dòng)員身上，經(jīng)常在其運(yùn)動(dòng)生涯結(jié)束后幾年開(kāi)始。

2 TBI與阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）

TBI是老年人群中的一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象，因?yàn)槔夏甓M(jìn)一步影響其預(yù)后。目前，65 歲以上的TBI 病例增加了21%。眾所周知，老年創(chuàng)傷患者的預(yù)后很差，康復(fù)情況不容樂(lè)觀，死亡率和功能殘疾率是年輕患者的2 倍。多達(dá)65%的中度至重度TBI 患者呈現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能障礙[8]。Luukinen 等[9]的研究提示，嚴(yán)重顱腦損傷的發(fā)生增加了認(rèn)知能力底下的風(fēng)險(xiǎn)，與沒(méi)有TBI的老年人相比，TBI老年患者認(rèn)知功能減退的趨勢(shì)明顯加快。因此，TBI 與年齡相關(guān)的大腦變化進(jìn)一步加劇認(rèn)知功能障礙。

AD 是一種多因素神經(jīng)退行性疾病，涉及多種不同的致病機(jī)制，存在多種高風(fēng)險(xiǎn)因素，其病因目前尚未得到充分了解。TBI 可能是AD 誘發(fā)因素[10]，其特征包括多個(gè)大腦區(qū)域的神經(jīng)元中存在AD 關(guān)鍵發(fā)病分子tau 蛋白異常過(guò)度磷酸化[11]。同時(shí)，AD 的另一分子標(biāo)志物β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）亦在部分TBI急性死亡患者中被發(fā)現(xiàn)[12]。因此，TBI與AD之間相互關(guān)系及潛在發(fā)生機(jī)制亟需闡明。

2.1 TBI 與tau 蛋白 tau 蛋白是微管相關(guān)蛋白家族的成員，主要功能受到磷酸化的嚴(yán)格調(diào)控[13]。然而，因相關(guān)蛋白激酶激活和（或）蛋白磷酸酯酶活性下調(diào)，tau 蛋白異常過(guò)度磷酸化，并在幾種神經(jīng)退行性疾病中異常聚集，這些疾病被統(tǒng)稱為tau 蛋白病[14]。最典型的tau 聚集體發(fā)生在AD 中，其中異常過(guò)度磷酸化的tau 蛋白聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs），在神經(jīng)元內(nèi)形成聚集體。作為AD 大腦兩大標(biāo)志性病變之一的NFTs 也是其它神經(jīng)退行性疾病的特征性病理特征，最近已在CTE 患者的大腦中發(fā)現(xiàn)了NFTs。但是，通常直到受傷后數(shù)月或數(shù)年才在TBI中觀察到由異常過(guò)度磷酸化tau蛋白組成的NFTs[15]。引發(fā)CTE 中tau 蛋白病變的神經(jīng)化學(xué)變化尚不清楚，但最近的研究表明TBI 誘導(dǎo)異常的軸突內(nèi)激活和激酶積累，可以促進(jìn)tau 蛋白磷酸化[16]。Tran 等[17]發(fā)現(xiàn)腦外傷可增強(qiáng)tau 蛋白的免疫反應(yīng)性和tau 蛋白磷酸化，且這些異常變化與TBI 嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

tau 蛋白沉積與AD 臨床癥狀的進(jìn)展亦呈現(xiàn)正相關(guān)[18]。Mohamed 等[19]的研究表明，與對(duì)照組相比，TBI 受試者大腦皮層中tau 蛋白沉積增多（10%～20%），其可能機(jī)制涉及TBI 促進(jìn)剪切力對(duì)軸突細(xì)胞骨架造成物理?yè)p傷，進(jìn)而使結(jié)合異常的tau 蛋白成核，促進(jìn)NFTs的形成[20]；另一種可能的機(jī)制是TBI引起血腦屏障損傷，促進(jìn)tau 蛋白積聚，從而誘導(dǎo)NFTs形成，通常在聚集于腦溝深處，特別是在皮質(zhì)小血管周?chē)?，最終可能導(dǎo)致CTE[21]。

TBI 后tau 蛋白病變發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚。由于tau 蛋白的磷酸化狀態(tài)受tau 蛋白激酶和磷酸酶的平衡調(diào)節(jié)控制，TBI 后tau 蛋白病變機(jī)制的另外一種可能是tau 蛋白激酶和磷酸酶的平衡失調(diào)[1]。Mouzon 等[22]在模擬TBI 的嚙齒動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，造成損傷2～3 個(gè)月后，總tau 蛋白水平和NFTs 顯著增加，并伴有白質(zhì)降解和神經(jīng)炎癥增加。因此，TBI 誘發(fā)AD 等一系列神經(jīng)退行性病變的本質(zhì)使人們相信，tau蛋白異常過(guò)度磷酸化是TBI相關(guān)AD的關(guān)鍵病變。

2.2 TBI 與Aβ Aβ 聚集形成的老年 斑（senile plaque，SP）是AD 的另一大病理特征[23]。Aβ 由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切而成。

流行病學(xué)研究表明，死于TBI 的患者中，有30%的腦中存在Aβ斑塊[24]。免疫組織化學(xué)分析顯示，TBI促進(jìn)受損的軸突中積累Aβ 裂解所需的酶。Chen等[25]在豬彌漫性軸突損傷模型和人TBI 患者的軸突腫脹中都發(fā)現(xiàn)了γ-分泌酶1 和β-分泌酶。這些研究均提示TBI可能引起Aβ毒性。APP具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能，包括促進(jìn)軸突發(fā)芽、神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和突觸發(fā)生，這對(duì)軸突損傷后的神經(jīng)元存活非常重要。Thornton等[26]研究發(fā)現(xiàn)，APP因腦損傷而上調(diào)，而上調(diào)α-分泌酶可競(jìng)爭(zhēng)性阻止β-分泌酶剪切APP，減少Aβ產(chǎn)生，從而減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性TBI 后神經(jīng)元丟失和軸索損傷。對(duì)人腦組織樣本的研究表明，在腦損傷后神經(jīng)元和軸突中APP 累積將導(dǎo)致軸突損傷[27]。對(duì)患有輕度TBI但死于其他原因的患者的腦組織樣本進(jìn)行的死后研究表明，這種APP積累可非常迅速地（在幾小時(shí)內(nèi)）發(fā)生，并且能夠存在于輕度創(chuàng)傷的情況下[28]。具有AD樣病變的APP轉(zhuǎn)基因小鼠在6 月齡時(shí)形成淀粉樣斑塊，這些動(dòng)物TBI后導(dǎo)致Aβ水平顯著升高，尤其是在海馬中。與未受傷的對(duì)照組相比，TBI 轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ 的高度聚集使海馬神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，與腦損傷的野生型小鼠相比，海馬神經(jīng)元的損傷也很?chē)?yán)重[29]。這些研究提示TBI進(jìn)一步促進(jìn)AD的病理變化。

3 天冬酰胺內(nèi)肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）與AD

AEP 也稱為δ-分泌酶或legumain（LGMN）。哺乳動(dòng)物的AEP 是溶酶體半胱氨酸蛋白酶，可在天冬酰胺殘基后特異性切割其底物。在人類(lèi)中，AEP 由位于染色體14q32.12上的LGMN基因編碼。與半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶相似，初合成的AEP 為含有C 和N 末端前肽的無(wú)活性酶原[30]。晶體結(jié)構(gòu)顯示，C端前結(jié)構(gòu)域覆蓋半胱天冬酶樣AEP 酶核心，并禁止底物接近該酶核心，從而阻止其酶促活性；在酸性條件下，其N(xiāo) 端和C 端片段自我裂解，其酶活性被激活[31-32]。因此，AEP 的酶活性受到pH 值嚴(yán)格調(diào)節(jié)[33]。癌癥和AD 的環(huán)境往往呈弱酸性，在這樣的病理?xiàng)l件下，AEP 將被激活。此外，AEP 的酶活性也受其他因素調(diào)節(jié)。例如，當(dāng)αVβ3整合素存在時(shí)，pH最佳值從5.5 升至6.0[32]。神經(jīng)元中AEP 存在翻譯后修飾，Akt 可磷酸化AEP 的T322 位點(diǎn)，從而抑制APP 自動(dòng)裂解和酶促反應(yīng)。在tau P301S 小鼠腦中，過(guò)表達(dá)模擬磷酸化AEP T322E 突變體可顯著抑制AEP 的活性，減弱tau 蛋白病變，減輕病理和認(rèn)知缺陷。Akt 激活受腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/原肌球蛋白受體激酶B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）信號(hào)通路調(diào)節(jié)，BDNF 的減少會(huì)減弱AEP T322 位點(diǎn)的磷酸化，引起AEP 的胞漿滯留和激活[34]。也有研究顯示，用TrkB 激動(dòng)劑可抑制AEP 的活化以及APP 和tau 蛋白的病理性切割，從而減輕AD病變和行為學(xué)異常[35]。

3.1 AEP 與tau 蛋白 有報(bào)道顯示，在AD 患者大腦中，AEP 活性上調(diào)，且存在AEP 剪切的tau 蛋白片段tau1-368。體內(nèi)和體外研究結(jié)構(gòu)均表明，AEP 在N368后裂解tau 蛋白，產(chǎn)生tau1-368片段。與全長(zhǎng)tau 蛋白相比，該片段更易于磷酸化，并喪失其微管組裝活性[36]。tau1-368片段與BDNF 同源受體TrkB 結(jié)合，阻斷神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[37]。另外，AEP活性和tau 蛋白裂解呈年齡依賴性增加[36]。因此，AEP可能在AD發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是tau 磷酸化主要的調(diào)節(jié)因子，PP2A 的抑制改變磷酸化和去磷酸化之間的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致tau 蛋白磷酸化增加。SET（SE translocation）是一種多功能蛋白質(zhì)，能夠通過(guò)與PP2A 催化亞基PP2Ac 相互作用而有效地抑制PP2A 活性，因此亦被稱為I2PP2A（inhibitor 2 of PP2A）[38]。在正常狀態(tài)下，SET 蛋白以二聚體的形式聚集于核中。但I(xiàn)2PP2A/SET在其N(xiāo)175處切割成NTF和CTF 末端片段后易位至細(xì)胞質(zhì)。這兩個(gè)片段都能夠有效抑制PP2A，從而促進(jìn)tau 蛋白的過(guò)度磷酸化，而SET 的CTF 過(guò)度表達(dá)可引起AD 病變和認(rèn)知障礙，表明SET 的切割可以在動(dòng)物模型中引發(fā)AD[39-40]。在AD大腦中，AEP能通過(guò)溶酶體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核并切割SET[41]。

3.2 AEP 與Aβ Aβ 是由β-和γ-分泌酶對(duì)跨膜蛋白APP 進(jìn)行順序水解切割而產(chǎn)生的。β-分泌酶裂解APP產(chǎn)生C端C99片段，此片段被γ-分泌酶進(jìn)一步裂解并產(chǎn)生Aβ。另外，APP 可以被Aβ 序列中的α-分泌酶切割，從而阻止了Aβ 的產(chǎn)生[42]。除α-、β-和γ-分泌酶外，研究者還鑒定出其他蛋白酶可裂解APP并調(diào)節(jié)其生理及病理功能[43-44]。例如，APP 經(jīng)η-分泌酶加工會(huì)產(chǎn)生抑制海馬神經(jīng)元活性的片段[44]。

研究發(fā)現(xiàn)AEP 表達(dá)水平以年齡相關(guān)的方式升高，并與老年大腦中的APP 片段緊密相關(guān)。值得注意的是，與健康對(duì)照組相比，AD 患者大腦中APP 裂解顯著增加。在5XFAD 小鼠模型中，AEP 的酶活性升高，且AEP 剪切生成的APP 片段APP586-695 更容易被β-分泌酶切割。因此，通過(guò)AEP 去除APP C 端片段可以緩解空間障礙，并通過(guò)β-分泌酶促進(jìn)APP處理，從而加速Aβ 的產(chǎn)生。此外，AEP 剪切生成的APP1-373 片段具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性。AD 患者大腦切片中，具有AEP剪切的APP586-695片段免疫反應(yīng)性的陽(yáng)性神經(jīng)元比例比對(duì)照組顯著增加；當(dāng)從5XFAD 小鼠中清除所有AEP 時(shí)，Aβ 斑塊面積減少至5XFAD小鼠的約60%[45]。所有這些研究都提示抑制AEP可能減輕AD的進(jìn)行性神經(jīng)變性。

4 AEP激活與TBI后的AD樣tau蛋白病變

tau 蛋白的磷酸化水平受到蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性平衡所調(diào)控，TBI 發(fā)生后，由于組織直接機(jī)械變形引起的繼發(fā)性損傷期間tau 蛋白的磷酸化水平可能會(huì)改變[1]。Hu 等[46]的研究顯示，TBI 可以導(dǎo)致腦組織中乳酸增加，這可能有助于AEP的激活。進(jìn)而AEP 切割SET 和tau 蛋白，從而間接導(dǎo)致AD 腦中tau 蛋白的過(guò)度磷酸化，引起AD 發(fā)生。該研究使用了重復(fù)性輕度腦損傷（r-mTBI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)3xTg-AD 小鼠腦中tau 蛋白過(guò)度磷酸化受到AEP 活化的影響。AEP 活化也與r-mTBI 后的tau 蛋白過(guò)度磷酸化有關(guān)，可能是通過(guò)切割SET 蛋白使其從神經(jīng)元細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并進(jìn)而抑制PP2A 活性，導(dǎo)致tau 蛋白異常過(guò)度磷酸化。利用經(jīng)典自由落體實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制中重度TBI 模型，應(yīng)用AEP 抑制劑下調(diào)AEP 活性，促進(jìn)SET 蛋白重新回到神經(jīng)元核內(nèi)，可解除對(duì)PP2A 的抑制，從而減輕tau 蛋白磷酸化水平，緩解突觸損傷和認(rèn)知功能障礙。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AEP 抑制劑能有效緩解AD 樣神經(jīng)退行性疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。

5 結(jié)論

盡管AD 研究領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)步，但AD 的診斷主要取決于臨床表現(xiàn)。因此，在臨床實(shí)踐中常常錯(cuò)過(guò)或延遲診斷和有效治療。TBI 與神經(jīng)退行性疾病，特別是TBI 誘發(fā)的AD 是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要進(jìn)行廣泛的研究才能更好地理解。目前TBI 相關(guān)AD 的研究主要聚焦在tau 蛋白病變、Aβ 沉積及臨床表征的癡呆發(fā)病機(jī)制。

TBI致大腦局部酸化環(huán)境導(dǎo)致AEP激活，激活的AEP 則可介導(dǎo)AD 關(guān)鍵分子tau 蛋白、SET 蛋白、APP等的水解過(guò)程。例如，通過(guò)AEP 截?cái)郤ET 蛋白會(huì)引起tau 蛋白異常過(guò)度磷酸化，而AEP 介導(dǎo)的APP 和tau 蛋白截?cái)喾謩e促進(jìn)Aβ 和tau 蛋白的沉積，從而導(dǎo)致Aβ毒性和tau蛋白病變，加重AD 的病變及行為學(xué)異常。因此，闡明AEP 在AD 進(jìn)程中對(duì)APP 和tau 蛋白的相互作用關(guān)系，以AEP產(chǎn)生的片段作為AD的診斷標(biāo)志物，或者找到更高效的AEP 抑制劑，將為T(mén)BI所引起的AD 樣神經(jīng)退行性病變的早期診斷和干預(yù)提供更好的策略。