孔亞敏，嚴(yán)雋陶，李華偉

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 鄭州450000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 推拿科，上海200437）

周圍神經(jīng)損傷（peripheral nerve injury,PNI）是致殘率較高的常見疾病，會引起該神經(jīng)支配區(qū)域功能出現(xiàn)部分缺失，造成運動、感覺等功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此PNI修復(fù)一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱門問題[1]。神經(jīng)外科醫(yī)生SUNDERLAND[2]在Seddon提出的神經(jīng)損傷Ⅲ度分類法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步細(xì)化，將神經(jīng)損傷分為V度。不同程度損傷所展示的病理表現(xiàn)各有特點，由于神經(jīng)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在體外研究PNI及再生的條件非常有限，因此根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇恰當(dāng)?shù)膭游飺p傷模型及正確的模型復(fù)制方法是研究PNI的關(guān)鍵。本文就現(xiàn)階段動物實驗中PNI模型做歸納總結(jié)，對模型復(fù)制過程中存在的優(yōu)點和不足進(jìn)行分析討論，以便進(jìn)一步指導(dǎo)PNI動物模型的復(fù)制。

1 手術(shù)器械性損傷模型

手術(shù)器械性損傷是PNI模型復(fù)制的主要方式，并被廣泛應(yīng)用于動物實驗。目前手術(shù)器械性損傷模型以橫斷傷、鉗夾傷等為主，常作用于神經(jīng)中較為粗大的神經(jīng)干，如坐骨神經(jīng)。

1.1 橫斷傷模型

橫斷傷模型即神經(jīng)干橫斷損傷，僅有部分外膜相連，或神經(jīng)干完全斷裂，符合Sunderland神經(jīng)損傷分類法中Ⅳ或V度損傷。1973年REUCK[3]通過坐骨神經(jīng)橫斷傷模型對大鼠失神經(jīng)與再神經(jīng)支配后腓腸肌肌纖維變化進(jìn)行觀察探討，為該模型提供方法，后不斷有學(xué)者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行完善總結(jié)。

DEDKOV等[4]通過對SD大鼠行右側(cè)坐骨神經(jīng)橫斷傷后的骨骼肌微循環(huán)研究發(fā)現(xiàn)：骨骼肌內(nèi)血管發(fā)生明顯改變，管壁變硬，管腔畸形，微循環(huán)床的毛細(xì)血管及細(xì)胞發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)重塑，肌肉萎縮程度與毛細(xì)血管網(wǎng)的減少及結(jié)締組織內(nèi)的纖維增生有關(guān)，為臨床研究PNI后骨骼肌萎縮微循環(huán)方向提供了理論依據(jù)。ISAACS等[5]切除2/3左側(cè)脛神經(jīng)后將神經(jīng)游離端縫入相鄰肌肉，并擠壓剩余1/3神經(jīng)5 s，對肌肉重量和收縮強度進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)：8周后腓腸肌收縮力與對照組比較有差異，但肌肉質(zhì)量差異不明顯。馬書杰等[6]充分暴露坐骨神經(jīng)后于梨狀肌下緣1 cm處橫斷，在10倍顯微鏡下立即縫合，用坐骨神經(jīng)橫斷傷立即縫合模型探討推拿聯(lián)合跑臺訓(xùn)練與坐骨神經(jīng)再生之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)推拿聯(lián)合跑臺能夠促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖，軸絲增加，軸突計數(shù)升高，提示推拿手法能夠促進(jìn)神經(jīng)再生，對臨床促進(jìn)神經(jīng)生長療效方面有一定意義。

在組織工程方面，復(fù)制神經(jīng)缺損模型也是研究的熱點。張偉才[7]通過手術(shù)橫斷切除坐骨神經(jīng)8 mm長度，在10倍顯微鏡下待游離端自然回縮至12 mm后植入神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)，對生物活性人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損進(jìn)行研究?，F(xiàn)階段在組織工程方面，常通過對生物聚合物、神經(jīng)導(dǎo)管等材料進(jìn)行移植研究，該研究為臨床促進(jìn)PNI后神經(jīng)再生以及尋求更合適的替代療法方面提供了新的方法[8-9]。

該模型在造模過程中重復(fù)性較好，且模型損傷級別較為一致，利于實驗定量定性分析。該模型不僅能夠模擬臨床中失神經(jīng)后發(fā)生的一系列病理變化，而且在研究失神經(jīng)肌萎縮及功能恢復(fù)方面也提供新的思路和方法[10-12]，尤其為針灸推拿治療PNI的長期觀察提供了依據(jù)[13-14]。但由于神經(jīng)切斷后軸漿外滲，為顯微鏡下神經(jīng)對位吻合修復(fù)增加了難度；另一方面來講，神經(jīng)修復(fù)過程中的瘢痕組織的增生，對神經(jīng)的再生及功能的恢復(fù)也有很大影響。

1.2 鉗夾傷模型

鉗夾傷模型即使用止血鉗或持針器給予坐骨神經(jīng)一定的壓力，使坐骨神經(jīng)形成相應(yīng)程度損傷的模型。該模型無需顯微鏡下行斷端吻合手術(shù)，一定程度上保持了神經(jīng)干的連續(xù)性，神經(jīng)外膜的完整性，使損傷部位的近端和遠(yuǎn)端一定程度上保持連接，為軸突的再生實現(xiàn)對靶器官的再支配提供了條件[15]。1943年GUTMANN等[16]在兔腓總神經(jīng)分別施以鉗夾、銳器橫斷及神經(jīng)移植縫合3種不同模型復(fù)制方法，比較三者之間病理學(xué)變化，對鉗夾傷進(jìn)行系統(tǒng)的概述，為坐骨神經(jīng)損傷模型的復(fù)制及應(yīng)用開創(chuàng)了新的方向。

PAN等[17]于大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)行30 s擠壓損傷復(fù)制大鼠擠壓傷模型，探討促進(jìn)PNI的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)推拿能夠促進(jìn)神經(jīng)生長因子及其受體TrkA的表達(dá)，加速坐骨神經(jīng)軸漿運輸，減少tPA及PAI-1的分泌，從而促進(jìn)損傷后神經(jīng)再生。但是該實驗并沒有清楚表明使用儀器的型號、壓力的大小、擠壓的損傷程度以及具體位置，無法進(jìn)行實驗重復(fù)，具有一定的缺陷。KARASAWA等[18]通過不同時間間隔對大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)行2重或3重鉗夾傷，探討不同時間間隔反復(fù)神經(jīng)損傷對功能恢復(fù)及神經(jīng)再支配的影響，發(fā)現(xiàn)重復(fù)損傷之間的時間間隔可能與功能恢復(fù)無關(guān)，但是重復(fù)損傷次數(shù)會影響運動功能的恢復(fù)。該模型在實驗中對擠壓儀器以及加壓時間做出明確定論，但是關(guān)于首次擠壓的具體位置尚未闡述。在組織生物學(xué)方面，MIRZAKHANI等[19]通過使用小型止血鉗在坐骨神經(jīng)分叉上2 cm處進(jìn)行擠壓，擠壓60 s，觀察神經(jīng)擠壓至透明后的縫合肌肉和皮膚，揭示坐骨神經(jīng)擠壓傷后抑制了抗氧化酶活性，誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，產(chǎn)生骨骼肌萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致運動功能障礙。對肌肽對坐骨神經(jīng)的再生以及功能恢復(fù)的的作用機(jī)理進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)肌肽是骨骼肌收縮作用中不可或缺的細(xì)胞質(zhì)二肽，自神經(jīng)釋放并參與神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)過程，可能在神經(jīng)與肌肉相互營養(yǎng)作用方面扮演重要角色。該模型確定了擠壓時間、損傷位置以及損傷程度，但是壓力大小以及止血鉗型號尚未指明。

該模型產(chǎn)生的瘢痕組織較少，操作簡便，由于保持了神經(jīng)干的連續(xù)性，因此有較好的恢復(fù)性，避免了對神經(jīng)切斷縫合技術(shù)的嚴(yán)格要求，常用于觀察坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)，尤其在對PNI恢復(fù)的短期觀察中應(yīng)用極為廣泛[20-22]。然而關(guān)于該模型的大多數(shù)研究對擠壓的損傷程度都沒有做定性定量分析，不能明確符合Sunderland損傷程度，關(guān)于擠壓的壓力、擠壓的部位、擠壓的損傷面積以及擠壓的時長等都尚未明確定論，操作時具有一定主觀性，加大了實驗誤差。

2 物理因素?fù)p傷模型

物理因素?fù)p傷模型是通過一些物理方法（液氮、電等）對坐骨神經(jīng)造成一定程度損害復(fù)制符合臨床需求的損傷模型，實驗中常見的物理因素?fù)p傷模型有冰凍損傷，電燒傷以及卡壓傷等。

2.1 冰凍損傷模型

冰凍損傷模型是通過低溫的方法對周圍神經(jīng)造成一定程度損傷的模型。早在1991年，KERNS等[23]就對大鼠坐骨神經(jīng)冰凍損傷與鉗夾傷后運動及感覺功能的恢復(fù)做出比較。同年，DELEO等[24]通過右側(cè)坐骨神經(jīng)凍融—冷凍循環(huán)的方式復(fù)制坐骨神經(jīng)冰凍損傷模型，探討周圍神經(jīng)低溫?fù)p傷后對脊髓背角P物質(zhì)含量的影響。復(fù)制大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛冰凍模型[25]，但由于該模型術(shù)后大鼠足部缺乏神經(jīng)支配易出現(xiàn)自發(fā)痛導(dǎo)致自殘情況發(fā)生。

JIA等[26]復(fù)制非凍結(jié)性神經(jīng)冰凍損傷模型并對發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，李浩等[27]對該模型進(jìn)行完善，通過應(yīng)用實驗設(shè)備使大鼠坐骨神經(jīng)保持在3～5℃，維持2 h，發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)冰凍損傷與血神經(jīng)屏障有密切關(guān)系，對神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)纖維等也有一定的影響。該模型避免了機(jī)械損傷，適用于病理機(jī)制方向的相關(guān)研究，但病理機(jī)制是一個復(fù)雜的共同作用的結(jié)果，研究方法仍需完善。趙曙光等[28]對大鼠坐骨神經(jīng)分別采取-60℃、-80℃、-100℃及-120℃復(fù)制模型，72 h后發(fā)現(xiàn)-60℃、-80℃組神經(jīng)內(nèi)膜、基底膜以及外膜均完整，神經(jīng)功能能夠完全恢復(fù)，該實驗對不同溫度下周圍神經(jīng)恢復(fù)情況進(jìn)行探討，并確定了周圍神經(jīng)冰凍損傷后能夠完全恢復(fù)的溫度區(qū)間，但在實驗過程中要時刻觀察大鼠生存狀態(tài)。

冰凍損傷模型一定程度上保證了神經(jīng)的完整性，避免了機(jī)械損傷，能夠模擬臨床神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯，適用于臨床研究病理機(jī)制以及功能恢復(fù)，尤其是感覺功能方面，是較好的選擇。但是周圍神經(jīng)的恢復(fù)是一個復(fù)雜的過程，是多因素共同作用的結(jié)果，所以該模型在研究單一PNI因素方面并不適用。由于實驗過程中低溫的要求，死亡率較高，要對大鼠實行實時監(jiān)測，以確保實驗的存活率。

2.2 卡壓傷模型

卡壓傷模型是利用硅膠管、尼龍線等方式對神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎或者持續(xù)卡壓，使坐骨神經(jīng)受到持續(xù)損傷的模型。臨床常見的卡壓傷模型有管卡壓模型、神經(jīng)結(jié)扎模型等。

1984年MACKINNON[29]將SD大鼠的坐骨神經(jīng)與不同內(nèi)徑1 cm長的管道進(jìn)行套合，使坐骨神經(jīng)受到持續(xù)性壓迫，復(fù)制慢性神經(jīng)卡壓傷模型。ZHENG等[30]對MACKINNON設(shè)計的卡壓模型進(jìn)行優(yōu)化總結(jié)，用與坐骨神經(jīng)直徑相一致的硅膠管縱向切開后套在坐骨神經(jīng)上，并用2根5-0手術(shù)線固定打結(jié)，研究慢性卡壓傷對坐骨神經(jīng)的影響。在形態(tài)學(xué)方面發(fā)現(xiàn)6周時硅膠管與神經(jīng)粘黏，卡壓處神經(jīng)明顯細(xì)化，硅膠管近遠(yuǎn)端明顯變粗，8周時卡壓處神經(jīng)出現(xiàn)硬化，硅膠管近遠(yuǎn)端出現(xiàn)瘤樣改變；組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，8周時髓鞘畸形，軸索扭曲，髓鞘板層密度不均，為臨床研究神經(jīng)性疼痛提供了參考。該模型可以看到神經(jīng)卡壓之后慢性變化的過程，避免了二次手術(shù)或多次手術(shù)造成的損傷，但是卡壓硅膠管的重量、卡壓的壓力、卡壓后神經(jīng)的損傷程度以及排異反應(yīng)等均不明確，仍需后期實驗完善。

1988年BENNETT等[31]使用結(jié)扎線對大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行復(fù)制模型，模仿臨床外周單神經(jīng)病變，為臨床研究奠定了基礎(chǔ)。KHANGURA等[32]游離出約10 mm長坐骨神經(jīng)后在神經(jīng)上使用鉻腸線進(jìn)行結(jié)扎，雙結(jié)之間間隔1 mm，共4個結(jié)，后立即縫合肌肉皮膚，發(fā)現(xiàn)吡侖帕奈能減少神經(jīng)性疼痛相關(guān)的機(jī)械性痛覺過敏及冷異常性疼痛，其原因可能是由于其抑制了AMPA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+、增加了突出傳遞的能力，該模型能較好的模擬臨床神經(jīng)性疼痛，產(chǎn)生自發(fā)痛行為，在研究藥物治療神經(jīng)性疼痛及其作用機(jī)理方面具有較好的選擇，但是該模型沒有明確結(jié)扎線的型號以及結(jié)扎的松緊程度，一定程度上增大了模型的誤差。XU等[33]鈍性分離并充分暴露坐骨神經(jīng)后，用3根4-0的線結(jié)扎于坐骨神經(jīng)，結(jié)與結(jié)之間相距1.0～1.5 mm，對熱痛敏及機(jī)械性痛敏進(jìn)行評估，探討神經(jīng)性疼痛的病理變化。該模型有利于對神經(jīng)疼痛障礙的神經(jīng)機(jī)制進(jìn)行探索，能產(chǎn)生熱痛敏、冷痛敏等反應(yīng)，可確定結(jié)扎線的型號。但是結(jié)扎仍具有一定的主觀性，無法確定對神經(jīng)纖維的損傷程度，存在一定的不足。

3 其他損傷模型

PNI模型方法繁多，除上述提出的造模方法外，還有一些其他損傷模型，例如藥物損傷、內(nèi)源性神經(jīng)病變及超聲定位損傷等。

臨床很多常用藥對神經(jīng)具有一定損害，當(dāng)損及神經(jīng)時，常會引起該神經(jīng)所支配區(qū)域出現(xiàn)運動及感覺功能異常。YU等[34]以股骨大轉(zhuǎn)子為標(biāo)志，剝離并充分暴露坐骨神經(jīng)干，在坐骨神經(jīng)干外膜處注射20萬u（0.5ml）青霉素鈉，復(fù)制坐骨神經(jīng)藥物損傷模型，觀察治療周圍神經(jīng)藥物損傷后的功能恢復(fù)，為臨床研究藥物對PNI及治療提供依據(jù)，但是造模過程中因注意枕頭刺入的深度以及藥物的吸收，避免藥物外泄及刺入過深。黃晶等[35]實驗探討低頻超聲對大鼠坐骨神經(jīng)的影響，充分暴露坐骨神經(jīng)干后在把超聲設(shè)備（直徑2 mm，頻率34 KHz，連續(xù)波）的導(dǎo)管末端安放于其上方約2 mm處，以8 w/cm2、18 w/cm2及32 w/cm2的聲強作用于神經(jīng)干，發(fā)現(xiàn)當(dāng)聲強為32 w/cm2作用于坐骨神經(jīng)后，神經(jīng)纖維出現(xiàn)斷裂、腫脹，低頻超聲則可使坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低。該模型定位準(zhǔn)確，易于操作，保持了外膜的完整性，利于神經(jīng)損傷后恢復(fù)，但是該模型對儀器的要求過高，且并不能體現(xiàn)臨床神經(jīng)損傷后一系列的病理變化，故臨床應(yīng)用較少。

4 討論與展望

正如本文所述，大多數(shù)PNI的研究是誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)損傷建立的?，F(xiàn)階段鉗夾傷、橫斷傷模型因損傷程度較好控制、操作簡便而被廣泛應(yīng)用，但是在實驗過程中，由于神經(jīng)損傷后運動、感覺等功能障礙以及神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的支持喪失，往往伴隨動物自噬、潰瘍等現(xiàn)象，因此應(yīng)即時處理傷口，避免動物脫落對實驗結(jié)果產(chǎn)生不利影響。PNI后修復(fù)是一個復(fù)雜的相互作用的結(jié)果，隨著臨床需求，其他實驗?zāi)Ｐ鸵仓饾u被提出。2009年RONCHI等[36]對大鼠正中神經(jīng)擠壓傷進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究，并對損傷后功能及形態(tài)學(xué)進(jìn)行評估。支配上肢單束存在的正中神經(jīng)，不同于多束的坐骨神經(jīng)，更利于行為學(xué)、形態(tài)學(xué)的觀察，因此逐漸應(yīng)用于實驗研究中[37-38]，但是也存在神經(jīng)較細(xì)小，對顯微技術(shù)要求較高的缺點。由于PNI后損傷程度評價技術(shù)（例如肌電圖、彌散張量成像技術(shù)等）仍不足夠明確，無法為PNI程度的統(tǒng)一性提供可靠的依據(jù)，一定程度上加大了PNI模型復(fù)制的誤差，對動物實驗中的損傷難以做到準(zhǔn)確評定，操作人員實驗過程中的操作習(xí)慣、技術(shù)熟練程度等也是模型復(fù)制的影響因素。

由此可見，PNI模型的復(fù)制仍有較大的發(fā)展空間，損傷程度、損傷范圍等都應(yīng)不斷完備，減少實驗中的差異性，為后續(xù)PNI后修復(fù)機(jī)制的研究提供可靠依據(jù)。不同的實驗?zāi)Ｐ途哂胁煌膽?yīng)用范圍，比如橫斷傷更適合于失神經(jīng)后肌肉萎縮及神經(jīng)再生的長期觀察[39-40]，而鉗夾傷則更傾向于PNI后運動、感覺等功能的短期修復(fù)[41-42]，卡壓傷則更方便于研究神經(jīng)長期壓迫后引起的神經(jīng)性疼痛[43-44]。因此，在模型復(fù)制過程中，應(yīng)了解各模型的優(yōu)點和不足，根據(jù)實驗的需求復(fù)制合適的模型，取之所長，避之所短；另一方面，PNI模型仍需不斷完善，確保模型的一致性以便于定量定性分析，從而為臨床研究提供更多簡單易操作、評價指標(biāo)客觀、重復(fù)性好的PNI模型。