劉麗巧，肖莎莎 綜述，米弘瑛 審校

(昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院/云南省第一人民醫(yī)院兒科 650032)

隨著圍生醫(yī)學(xué)及NICU技術(shù)的不斷發(fā)展,極低出生體重兒和超低出生體重兒的存活率明顯提高,支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的發(fā)病率也逐年上升[1-2]，由于出生胎齡小，肺發(fā)育極度不成熟,呼吸系統(tǒng)后遺癥已成為早產(chǎn)兒長期患病和死亡的重要原因之一[3]。BPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍不明確。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示BPD為一種多因素疾病，是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[4]，即在遺傳易感性的基礎(chǔ)上各種不利因素如氧中毒、氣壓傷、容量傷、炎癥等導(dǎo)致的肺損傷，以及損傷后肺組織的異常修復(fù)，其中炎性損傷與損傷后修復(fù)均受基因易感性調(diào)控[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在胎齡、出生體重和治療措施相同的情況下，并非所有的早產(chǎn)兒均發(fā)生BPD，其預(yù)后也不盡相同。1項(xiàng)對雙胞胎的研究發(fā)現(xiàn)，同卵雙胞胎BPD患病率明顯高于異卵雙胞胎，不同種族新生兒BPD患病情況也有明顯的差異性。這些均提示BPD的發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)?；仡櫼酝难芯浚偨Y(jié)遺傳相關(guān)疾病的研究方法有：家系研究、雙胎研究、全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因研究等，其中候選基因研究具有明顯假設(shè)驅(qū)動(dòng)優(yōu)勢，即候選基因的選擇來源于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、早期人體研究或相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)理論，這些研究中基因改變可引起蛋白結(jié)構(gòu)甚至功能改變。近年來一些相關(guān)基因的多態(tài)性在BPD發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益受到重視。BPD已被證實(shí)與相關(guān)基因的多態(tài)性、表達(dá)異常有關(guān)，如血管表皮生長因子(VEGF)，肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SPs)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及表面活性蛋白D(SFTPD)基因[6-9]，但多數(shù)相關(guān)的候選基因與BPD的關(guān)系需進(jìn)一步明確。其中睪素2(SPOCK2)基因特別受關(guān)注，但其與BPD發(fā)生的關(guān)系尚不完全清楚，因此本文就SPOCK2基因多態(tài)性與早產(chǎn)兒BPD的相關(guān)性研究進(jìn)展予以綜述。

1 關(guān)于SPOCK2

SPOCK2,又稱Testican-2,屬于基質(zhì)細(xì)胞蛋白家族(secreted protein，acidic，cysteine-rich，SPARC)成員之一。SPARC的作用是在細(xì)胞增殖、周期進(jìn)程、凋亡、黏附和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用等生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。目前已知的同源物為SPOCK-1,SPOCK-2和SPOCK-3；SPOCK2最初被描述為精液中的一種未命名的軟骨素/乙酰硫酸蛋白多糖，后來在篩選人cDNA文庫中發(fā)現(xiàn),它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，目前在人類的卵巢、睪丸、肺、前列腺和腎臟[10-11]均發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)人類的乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜癌與SPOCK2的甲基化密切相關(guān)[12-13]。

2 SPOCK2的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與BPD

HADCHOUEL等[14]首先觀察到SPOCK2基因在大鼠肺部的高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)SPOCK2是BPD發(fā)生的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因，SPOCK2基因上的SNP rs1049269的關(guān)聯(lián)僅見于白種人(P=0.025,OR=1.79)，而rs1245560的關(guān)聯(lián)在白種人(P=0.02,OR=1.85)及非洲人(P=0.007，OR=2.43) 中均可見，并且這種關(guān)聯(lián)在輕度BPD患兒中并未顯示，只在中-重度 BDP患兒中發(fā)現(xiàn)，基于輕度BPD不受遺傳影響，而中-重度明顯受遺傳因素的影響，為了系統(tǒng)性研究遺傳對極低出生體重兒罹患中、重度 BPD的影響，WANG等[15]使用了一種基于大群體的方法，采用全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)和基于外顯子組的基因型鑒定平臺(tái)，評估了數(shù)以百萬計(jì)的SNP，結(jié)果既沒有在全基因組顯著性水平上鑒定出與中-重度BPD相關(guān)的SNP，也沒有重復(fù)出既往的發(fā)現(xiàn)。對于既往研究中發(fā)現(xiàn)的與BPD有關(guān)的27個(gè)SNPs，如表面活性蛋白 D (SFTPD)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、超氧化物歧化酶3(SOD3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-16(MMP-16)及選擇素L(SELL)等均P<0.1,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究認(rèn)為最有可能與BPD相關(guān)的SNP是rs118078182，這是一種在發(fā)育中的肺間質(zhì)中表達(dá)的跨膜膠原，但是由于復(fù)制樣本量是有限的，真實(shí)的信號(hào)可能沒有被檢測到。與此同時(shí)，其他學(xué)者認(rèn)為，以P值小于5×10-8的標(biāo)準(zhǔn)對于全基因組來說太過嚴(yán)格，導(dǎo)致檢測結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，MAHLMAN等[16]在BPD 的GWAS中發(fā)現(xiàn)，沒有一個(gè)SNP達(dá)到嚴(yán)格的全基因組顯著性水平，但存在許多提示性關(guān)聯(lián)，研究中發(fā)現(xiàn)中-重度BPD與SNP rs11265269之間存在明顯暗示性關(guān)聯(lián)，并且這種聯(lián)系在芬蘭人口和法國的非洲裔嬰兒中得到了復(fù)制。盡管最初的GWAS信號(hào)無一個(gè)得到一致的復(fù)制，但其中一些可能代表了真正的關(guān)聯(lián)信號(hào)。例如，在GWAS中提示與BPD相關(guān)的SNP中，RASGFR1(編碼Ras蛋白特異性鳥嘌呤核苷酸釋放因子1)內(nèi)的SNP可能代表真正的關(guān)聯(lián)，因?yàn)槲挥谠摶蚋浇钠渌鸖NP在BPD的先前GWAS中顯示關(guān)聯(lián)信號(hào)。此外，其他一些具有提示性相關(guān)SNP的基因可能在生物學(xué)上與BPD表型相關(guān)。例如，已知SGCD基因(編碼肌聚糖)與氣道反應(yīng)性相關(guān)，這一過程與COPD患者的肺功能下降有關(guān)，這些都需要更大規(guī)模的研究來評估這些基因在BPD中的潛在作用。

WANG等[15]在進(jìn)行基因分型時(shí)發(fā)現(xiàn)：主成分分析的前3個(gè)組成部分確定了4個(gè)種族群體，分別代表非洲裔美國人，西班牙裔美國人，白種人和亞洲人,并且在每個(gè)種族亞群中確定的SNP沒有重疊，比如在白種人群中發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的SNP rs6988306在其他種族中均無重復(fù)；MAHLMAN等[16]研究中強(qiáng)關(guān)聯(lián)的rs11265269也僅在芬蘭人口和法國的非洲裔嬰兒中得到了復(fù)制。盡管既往研究種族混合群體中已顯示出BPD對成人和兒童肺功能的影響，并且最新的研究也顯示BPD具有明顯種族差異性[17]，但在不同人種中的BPD與SPOCK2的基因相關(guān)性還需進(jìn)一步證實(shí)。

3 SPOCK2在BPD中可能的作用機(jī)制

3.1 SPOCK2與MMPs

HADCHOUEL等[14]觀察到SPOCK2基因在大鼠肺部高表達(dá)，而且在肺的發(fā)育過程中SPOCK2 mRNA水平變化顯著。一般來說，肺泡化通常發(fā)生在大鼠的第4～21天，他們發(fā)現(xiàn)SPOCK2基因的表達(dá)在肺發(fā)育過程的微觀和囊泡階段表達(dá)水平非常低，而在肺泡化時(shí)開始顯著升高，在第18天時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值，一直持續(xù)至第28天,隨后降低至正常新生鼠的水平，這提示肺發(fā)育和終止過程與SPOCK2密切相關(guān)。HADCHOUEL等還發(fā)現(xiàn)SPOCK2是由肺成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成的，然后沉積在包括基膜在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，免疫熒光研究顯示SPOCK2在整個(gè)ECM中均表達(dá)。

有研究表明SPOCK2與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-14、MMP-16相互作用，在肺發(fā)育中起關(guān)鍵作用并與BPD風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[18-20]，并且于正在發(fā)育的肺中，MMP-2在次級(jí)分離過程中充當(dāng)主要的蛋白酶。SPOCK1和SPOCK3可抑制MMP-14和MMP-16，并將pro-MMP-2水解成其活性形式，而SPOCK2則通過其NH2末端獨(dú)特結(jié)構(gòu)域與SPOCK3的COOH末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，消除這種抑制作用，從而使得MMP-2被激活，最終促進(jìn)ECM的降解和細(xì)胞的遷移和侵襲[18]。為進(jìn)一步研究SPOCK2在肺發(fā)育過程中的作用是否由MMP-2激活介導(dǎo)，HADCHOUEL等[21]設(shè)計(jì)了SPOCK2抗體在高氧條件下和在空氣中對MMP-2的激活作用，結(jié)果顯示與之前的報(bào)道一致[22]：在空氣暴露的大鼠中MMP-2活性顯著減少，而高氧條件下MMP-2的活性被激活，但在高氧條件下，注射生理鹽水的動(dòng)物和注射抗體的動(dòng)物之間MMP-2的激活率無顯著差異，基于此，他們認(rèn)為SPOCK2在肺泡發(fā)育中的作用可能與MMP-2激活有關(guān)，但由于缺乏相關(guān)模型印證，該假設(shè)并未被確認(rèn)。

3.2 SPOCK2與肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化

為進(jìn)一步研究SPOCK2在肺發(fā)育過程中的作用，HADCHOUEL等[21]設(shè)計(jì)了兩種小鼠模型，一種使用特定的SPOCK2抗體，一種通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型重現(xiàn)高氧誘導(dǎo)的SPOCK2表達(dá)，從而導(dǎo)致條件性和肺靶向SPOCK2的表達(dá)。在高氧條件下飼養(yǎng)小鼠時(shí)，用SPOCK2抗體治療可顯著改善肺泡形成。SPOCK2的過度表達(dá)改變了在室內(nèi)空氣中繁殖的幼鼠的肺泡發(fā)育，并加劇了高氧血癥引起的病變。這項(xiàng)研究為SPOCK2對肺泡發(fā)育的有害作用提出了有力的論據(jù)，尤其是在肺損傷后，提示其在BPD敏感性中的作用,這些作用不是通過金屬蛋白酶活性的釋放和正常肺泡形成所必需的因子的表達(dá)來介導(dǎo)的,可能涉及Ⅰ型(AT1)和Ⅱ型上皮肺泡細(xì)胞(AT2)之間的平衡。

有研究證實(shí)了AT2在發(fā)育過程及肺損傷后充當(dāng)AT1的祖細(xì)胞[23]，而SPOCK2是AT2向AT1轉(zhuǎn)化的早期標(biāo)志[24]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)AT2細(xì)胞在膠原上培養(yǎng)時(shí)，SPOCK2促進(jìn)其快速向AT1的轉(zhuǎn)分化，而當(dāng)AT2細(xì)胞在基質(zhì)凝膠上培養(yǎng)時(shí)，SPOCK2的表達(dá)水平并無改變[24]。通過對轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠的肺進(jìn)行形態(tài)分析，HADCHOUEL等[21]證明了SPOCK2在肺泡發(fā)育中的有害作用，這在肺損傷后表現(xiàn)尤為明顯，同時(shí)也提示其在BPD易感性中的作用，這種效果可能是由AT2和AT1細(xì)胞之間的失衡介導(dǎo)，但是由于缺乏足夠的AT2細(xì)胞來進(jìn)行細(xì)胞增殖和修復(fù)，這是二次分裂和最終肺泡形成所必需的。這個(gè)假設(shè)需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

3.3 血液中的微RNA(miRNAs)可成為新生兒BPD的標(biāo)志物

研究發(fā)現(xiàn)rs1049269這個(gè)SNP位點(diǎn)位于SPOCK2基因的3′UTR區(qū)域，根據(jù)理論推測可能會(huì)影響miRNA的結(jié)合，調(diào)控SPOCK2基因的后轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而對BPD的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。miRNAs屬于內(nèi)源性非編碼RNA,長約20～22個(gè)核苷酸。miRNAs不編碼蛋白，但在基因表達(dá)中發(fā)揮十分重要作用，主要顯示在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。大部分miRNAs位于內(nèi)含子區(qū)，少數(shù)位于外顯子區(qū)。miRNAs先在核內(nèi)由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初miRNAs(primary miRNAs，pri-miRNAs)，pri-miRNAs在Drosha-DGCR8復(fù)合物的作用下形成帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNAs(precursor miRNAs，pre-miRNAs)，再與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(exportin-5)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，并由Dicer酶剪切形成雙鏈的miRNA(miRNA-3p和miRNA-5p),這是來自于pre-miRNAs的互補(bǔ)的兩條鏈。在與靶位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，其中任意一條鏈均可作為成熟miRNAs，miRNAs 與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex RISC)整合，通過其5′端第2～8位堿基與靶基因mRNA 3′UTR 結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的翻譯或使其降解，從而抑制基因的表達(dá)。在新生兒BPD中，WU等[25]在15例對照組和15例BPD患兒中，對365個(gè)miRNAs進(jìn)行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNAs (miR-152,miR-30a-3p,miR-133b,和miR-7) 出現(xiàn)了異常的表達(dá)。臨床上也多次報(bào)道了肺發(fā)育過程中miRNA的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)和接觸調(diào)節(jié)。 HU等[26]發(fā)現(xiàn)miR-29a的下調(diào)可以共同提高GAB1的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡并刺激增殖，最終阻礙BPD的發(fā)展。SHAH等[27]發(fā)現(xiàn)miR-184-3p的過表達(dá)加劇了BPD肺表型，而下調(diào)miR-184-3p的表達(dá)改善了BPD的表型并改善了呼吸功能。上述研究均提示血液中的miRNAs成為新生兒BPD的標(biāo)志物是可行的。米弘瑛等[28]通過熒光定量PCR技術(shù)分析SPOCK2的表達(dá)水平，和可能與該基因在rs1049269位點(diǎn)相結(jié)合的3個(gè)miRNAs(miR-194，miR-939和miR-449b)的表達(dá)水平，探明SPOCK2基因及與該基因3′UTR結(jié)合的miRNAs在中國人群的表達(dá)水平變化，分析SNP對miRNAs與SPOCK2基因結(jié)合性的影響，結(jié)果顯示SOPCK2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1049269 AG基因型和G等位基因頻率與BPD有關(guān)，是BPD發(fā)病的高危因素，但是由于該研究納入的病例較少，因此尚未進(jìn)行rs1049269與不同程度BPD的相關(guān)性分析。此外，由于rs1049269位于SPOCK2基因的3′UTR區(qū)域，推測該位點(diǎn)可能通過影響某些miRNAs同SPOCK2的結(jié)合進(jìn)而影響SPOCK2的表達(dá)，但這仍需進(jìn)行更深入及更大樣本量的研究驗(yàn)證。

4 展 望

綜上所述，SPOCK2與BPD的相關(guān)性目前仍未明確。全基因組關(guān)聯(lián)研究也并未發(fā)現(xiàn)特定的SNP位點(diǎn)[16-17]，這提示BPD可能不是由單個(gè)基因介導(dǎo)，而是多基因介導(dǎo)的疾病,未來需要更大樣本的研究和更深入的動(dòng)物試驗(yàn)加以驗(yàn)證。至今為止，基于BPD的分子遺傳學(xué)研究結(jié)果間的一致性也較低，尚無公認(rèn)的研究結(jié)論[30]。作為一個(gè)多系統(tǒng)共同參與、病理生理復(fù)雜的疾病，BPD對患兒的影響可持續(xù)至整個(gè)嬰兒期甚至成年早期，最新的研究揭示：BPD早產(chǎn)兒發(fā)展為慢性阻塞性肺疾病(COPD)的風(fēng)險(xiǎn)較大，這是一種威脅人類生命的肺部疾病，幾乎無有效的治療方法[31]。因此，研究BPD的發(fā)病機(jī)制具有重大臨床意義，相信隨著未來醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，SPOCK2基因多態(tài)性與BPD的關(guān)系研究會(huì)越來越深入，越來越明確，為BPD的發(fā)病機(jī)制、治療提供新的思路和方向。