秦玉明，彭小薇，馮 宇，范學(xué)政，張瑩輝，丁家波

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，國家/OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室，北京 102600)

布魯氏菌病(布病)是一種由布魯氏菌感染多種動(dòng)物，包括野牛、鹿、野兔等多種野生動(dòng)物的人獸共患傳染病。野生動(dòng)物的人獸共患傳染病研究具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。鹿是除牛、羊、豬等家畜之外對布魯氏菌易感的野生動(dòng)物。由于野生鹿長期帶菌，鹿的布病具有十分重要的自然疫源性屬性[1]。近年來，隨著我國鹿產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，加強(qiáng)鹿布病防治對我國野生動(dòng)物資源保護(hù)、周邊的牛羊等畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義[2]。本文通過對國內(nèi)外鹿布病流行情況和防控經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)闡述，為我國鹿行業(yè)布病的防控提供參考與借鑒。

1 鹿的布病流行情況

自Rush于1932年首次從黃石公園中67份麋鹿血清中檢測到血清陽性反應(yīng)以來，世界各國陸續(xù)在野生的馴鹿、梅花鹿、馬鹿等鹿群中發(fā)現(xiàn)布魯氏菌感染[3]。其中，豬種4型布魯氏菌在西伯利亞、加拿大和美國阿拉斯加等北極周邊地區(qū)的野生和家養(yǎng)馴鹿中已有流行[4]，成為威脅當(dāng)?shù)鼐用衽c家畜的一種重要人獸共患傳染病。Judit E.G. Smits經(jīng)過10年跟蹤調(diào)查美國懷俄明州國家麋鹿保護(hù)區(qū)和加拿大西部共32個(gè)流產(chǎn)野生鹿胎兒，其中8個(gè)(占25%)鹿胎兒確診為感染牛種布魯氏菌[5]?？梢酝茰y，美洲野生麋鹿中布病已經(jīng)較為嚴(yán)重。

我國對野生鹿群布病流行情況調(diào)查比較零散。在新疆和東三省地區(qū)飼養(yǎng)的馬鹿與梅花鹿的布病流行情況也不容樂觀。金根源等在1993年收集新疆轄區(qū)7年內(nèi)47份野生馬鹿的血清型檢測，其抗體陽性率達(dá)到8.7%，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其他野生動(dòng)物布病感染的情況[6]。莫哈塔爾等2001年檢測新疆塔里木地區(qū)531頭份的飼養(yǎng)馬鹿血清，陽性率高達(dá)36.35%，從流產(chǎn)的馬鹿胎兒體內(nèi)分離到2株羊種3型布魯氏菌[7]。趙燕輝等在2010年發(fā)現(xiàn)新疆塔里木地區(qū)圈養(yǎng)馬鹿布病抗體陽性率也高達(dá)22%[8]。多里坤·努爾沙發(fā)等2008年報(bào)道新疆布爾津飼養(yǎng)的某馬鹿場布病抗體陽性率甚至已經(jīng)達(dá)到80%[9]。李玉梅等人2005年對來自吉林與黑龍江飼養(yǎng)的847頭梅花鹿的血清檢測發(fā)現(xiàn)，布病陽性率分別為8.87%和26.39%[10]。杜銳等人2003年用ELISA方法對東北某飼養(yǎng)的馴鹿場300份血清布病抗體檢查，陽性率也達(dá)到14%[11]。緊鄰吉林省的朝鮮半島圈養(yǎng)的麋鹿也有布病流行。Her M報(bào)道，該鹿場18頭麋鹿有7頭為抗體陽性，并從3頭陽性麋鹿體內(nèi)分離到布魯氏菌。

2 鹿布病臨床癥狀及診斷

2.1 臨床癥狀 潛伏期從兩周至半年不等，發(fā)病鹿多呈慢性經(jīng)過，多無明顯癥狀。首次妊娠母鹿在懷孕6-7月齡時(shí)易流產(chǎn)，流產(chǎn)胎兒多為死胎，有惡臭，胎衣不下，伴有子宮內(nèi)膜炎，乳腺炎等。公鹿則表現(xiàn)為陰囊下垂，單側(cè)或者雙側(cè)睪丸腫大，甚至變堅(jiān)硬；少部分則膝關(guān)節(jié)腫大甚至破潰，大部分因增生引起關(guān)節(jié)畸形，病變關(guān)節(jié)同側(cè)畸形。所產(chǎn)仔鹿即使存活也多表現(xiàn)行動(dòng)困難而最終淘汰[13-14]。

2.2 診斷方法 病原分離仍是布病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但因其分離培養(yǎng)時(shí)間長，分離率較低，且需要BSL-3級實(shí)驗(yàn)室，不便于臨床診斷。近些年，發(fā)展較快的是免疫學(xué)診斷技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)。

2.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn) 虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)是操作最簡單、成本低且快速的診斷方法，適合廣大養(yǎng)殖場現(xiàn)場快速診斷。該方法敏感性較高，但特異性不太高，存在一定比例誤判的情況。近年來，OIE在國際貿(mào)易中[15]不推薦該方法。鹿場使用該方法也會(huì)產(chǎn)生一定比例的誤判，造成鹿群布病凈化上的困難。

2.2.2 試管凝集試驗(yàn) 該方法也是布病診斷常規(guī)方法。當(dāng)被檢鹿的血清1∶100稀釋出現(xiàn)(++)及以上者判為陽性，1∶50(++)為可疑。對可疑者應(yīng)在10～25 d內(nèi)重復(fù)檢驗(yàn)，以進(jìn)一步確診[16]。但該方法操作繁瑣，至少需要1天時(shí)間，現(xiàn)場操作不方便，且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。近年來，OIE在國際貿(mào)易[15]也已不推薦該方法。

2.2.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是布病診斷經(jīng)典方法。雖然該方法操作復(fù)雜，但一直是布病血清學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也為OIE推薦布病診斷方法。由于豬的血清中補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體，所以補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)不能用于對豬個(gè)體進(jìn)行診斷[17]。

2.2.4 ELISA實(shí)驗(yàn) 1976年，Carlsson首次通過ELISA方法對布病進(jìn)行診斷[18]?，F(xiàn)已有多名學(xué)者建立了針對布病的多種ELISA檢測方法。由于競爭ELISA方法不受動(dòng)物種類的影響，所以對于鹿等野生動(dòng)物來說更為適用，且結(jié)果判定不受實(shí)驗(yàn)人員主觀判定的影響。因不同廠家試劑盒敏感性存在差異，檢測結(jié)果可能不一致。國家動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室(布病參考實(shí)驗(yàn)室)開發(fā)的布病競爭ELISA方法，將診斷臨界值統(tǒng)一到補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，兩者符合率接近100%。

2.2.5 膠體金免疫層析技術(shù) 免疫膠體金快速診斷技術(shù)具有高度特異性和高敏感性，結(jié)果快速、準(zhǔn)確，直觀可靠，而且所需試劑和樣品用量極少，無需專門的檢測設(shè)備，是目前發(fā)展較快的復(fù)合型免疫技術(shù)。布病參考實(shí)驗(yàn)室利用布魯氏菌特異性單克隆抗體研制出布病膠體金試紙條(競爭法)，實(shí)現(xiàn)了對于不同類型動(dòng)物布病抗體檢測。

2.2.6 熒光偏振(FPA) Nielsen博士[20]于2002年首次報(bào)到了利用熒光偏振技術(shù)檢測動(dòng)物血清和乳汁中布病抗體。該方法用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記布魯氏菌的免疫優(yōu)勢O-多糖抗原(OPS)。該方法的敏感性與特異性均較高，是OIE推薦用于國際動(dòng)物貿(mào)易中布病的檢測方法。該方法需使用專用儀器只需20分鐘即可實(shí)現(xiàn)高通量檢驗(yàn)，對于大型牧場動(dòng)物布病的監(jiān)測與檢驗(yàn)具有不可比擬的優(yōu)勢。因設(shè)備比較昂貴，阻礙其在基層養(yǎng)殖戶的推廣使用。

2.2.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) 曾有報(bào)道用該方法在63 ℃反應(yīng)1小時(shí)，就可以實(shí)現(xiàn)對血液樣品中對牛種布魯氏菌進(jìn)行檢測[21]。與常規(guī)PCR相比，其檢測限可以達(dá)到17 pg，與傳統(tǒng)PCR符合率達(dá)到91%，特異性達(dá)到87%，敏感性達(dá)到100%。由于檢驗(yàn)時(shí)間短，儀器設(shè)備比較簡單，肉眼即可準(zhǔn)確判斷結(jié)果，非常適用于田間養(yǎng)殖場或者野生鹿群的監(jiān)測[22]。但是，LAMP也存在多重?cái)U(kuò)增較為困難，樣本易受到污染等問題，引物設(shè)計(jì)要求較高等限制性因素。

2.2.8 AMOS-PCR AMOS-PCR檢測方法根據(jù)布魯氏菌不同種屬在IS711基因上的差別設(shè)計(jì)相關(guān)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)片段大小不同，以區(qū)分鹿等野生動(dòng)物較為易感的如羊種、牛種、豬種等種屬的布魯氏菌。該方法較為簡單快捷，敏感性和特異性較好，適用于對布魯氏菌種屬的初步鑒定。但是AMOS-PCR只能鑒定牛種布魯氏菌1、2、4型，對于其他生物型無法進(jìn)行擴(kuò)增，容易出現(xiàn)漏檢情況[23]。

2.2.9 Ladder-PCR Ladder-PCR方法最早于2008年由西班牙學(xué)者首先建立，并得到廣泛使用。該方法也已被收錄到OIE布病診斷標(biāo)準(zhǔn)中。2011年，該學(xué)者又對原有方法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，解決了部分豬種布魯氏菌容易與犬種布魯氏菌混淆的問題[25]。該方法通過8對特異性引物，實(shí)現(xiàn)對所有經(jīng)典布魯氏菌菌株以及A19、Rev.1、RB51等疫苗株的鑒別問題，比原有生化鑒定方法更簡單快速，特異性更好。但是，該方法也存在一定的局限性。該方法只適用于細(xì)菌純培養(yǎng)物的鑒定，不能用于病料組織等未進(jìn)行分離培養(yǎng)的樣品，對實(shí)驗(yàn)室生物安全等級要求較高；由于PCR反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)添加了16條引物，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對樣品和體系優(yōu)化的條件要求較高，不適用于臨床快速檢測。

3 防 控

3.1 養(yǎng)殖鹿群的防控 鹿的布病為慢性感染性疾病，除了妊娠母鹿可能發(fā)生流產(chǎn)外，其他感染鹿多呈隱性感染，往往被人們所忽略。鹿群一旦引入未經(jīng)檢驗(yàn)合格的患病種鹿，很難徹底清除。所以，對圈養(yǎng)的鹿群布病防控一定要堅(jiān)持“預(yù)防為主，預(yù)防與控制凈化相結(jié)合”的原則。對于未發(fā)生布病的鹿群堅(jiān)持“自繁自養(yǎng)”的原則，引種必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢疫，且需要至少30天的隔離觀察，經(jīng)2次檢測均為陰性后才能合群。此外，對鹿場還要加強(qiáng)每年至少2次常規(guī)的布病抗體監(jiān)測，禁止在鹿場內(nèi)飼養(yǎng)牛、羊、犬等家畜，以防止布病跨種間傳播。對于發(fā)生因布病流產(chǎn)的鹿群則要果斷采取隔離與消毒措施，對流產(chǎn)胎兒、胎衣和污染的圈舍環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。對鹿群綜合采取檢疫、淘汰、隔離、免疫、消毒等措施消除傳染源，切斷傳播途徑，保護(hù)易感鹿等措施[26]，飼養(yǎng)管理人員尤其要注意對發(fā)病鹿隔離飼養(yǎng)管理中的自我防護(hù)，防止人員感染。由于鹿的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，對于因?yàn)椴疾「腥径仨毺蕴穆梗胤秸贫ㄑa(bǔ)償標(biāo)準(zhǔn)，便于推進(jìn)撲殺等無害化處理工作。

如果流產(chǎn)鹿的比例較大，或者布病抗體監(jiān)測時(shí)陽性率突然增多，則可以考慮對鹿群進(jìn)行主動(dòng)免疫布病活疫苗，以盡快降低流產(chǎn)率，防止疫情在鹿群內(nèi)擴(kuò)散。

目前我國家畜常用的布魯氏菌疫苗有3種，分別為布魯氏菌弱毒活疫苗S2株、A19株、M5株。我國部分學(xué)者探索嘗試采用上述疫苗免疫鹿群，獲得初步成功。黃雨田等研究[27]采用A19疫苗皮下注射400億CFU對成年母鹿免疫，然后口服S2疫苗500億CFU，鹿場的流產(chǎn)率由15.8%下降到零。新增人員感染率由19%下降到零，取得非常好的防控效果。王自然[26]將鹿群中陽性感染鹿淘汰后，對群體采用口服強(qiáng)力霉素等藥物預(yù)防結(jié)合M5疫苗免疫的方式，也取得不錯(cuò)的效果。但是，因至今無法區(qū)分布魯氏菌自然感染與光滑型疫苗免疫抗體等問題，且其對鹿的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也較少。因此，對于飼養(yǎng)鹿群何時(shí)使用布病活疫苗進(jìn)行防控仍然需要進(jìn)一步研究。

3.2 野生鹿群的防控 對野生鹿群進(jìn)行疫苗免疫，首先要考慮對野生鹿群和其他非靶易感野生動(dòng)物的安全性進(jìn)行科學(xué)評估。在對鹿及其他附近的野生動(dòng)物無安全散毒風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)上，還要考慮免疫途徑問題。對于具有地理優(yōu)勢封閉的小范圍地區(qū)，可以考慮采用誘捕麻醉逐只注射免疫，以減少對其他非靶動(dòng)物布病感染風(fēng)險(xiǎn)；對于較大自由活動(dòng)范圍地區(qū)內(nèi)，人工捕獲進(jìn)行逐只免疫，勞動(dòng)強(qiáng)度太大，很難實(shí)現(xiàn)，無法確保免疫密度。所以，可以參考美國或者加拿大等國家野生動(dòng)物保護(hù)區(qū)的做法，采用欄桿將野生鹿群與家畜進(jìn)行物理隔離，以減少布病跨種間傳染。

Cook等人[28]在2002年研究表明，對32頭麋鹿分2組，分別肌肉注射RB51免疫10億CFU和1億CFU，然后待其懷孕后用107個(gè)CFU的2308毒株攻擊，保護(hù)效果不明顯。隨后，美國的懷俄明州有關(guān)部門又進(jìn)行麋鹿加大免疫劑量的試驗(yàn)。試驗(yàn)選擇30頭麋鹿肌肉注射免疫100億CFU的RB51疫苗，1年后，隨機(jī)對其中14頭進(jìn)行加強(qiáng)免疫1次。再經(jīng)過1年后用1.1×107CFU的2308強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒保護(hù)。結(jié)果表明，即使加大劑量加強(qiáng)免疫后，RB51疫苗對麋鹿布病防控效果仍不明顯。所以，在野生動(dòng)物中是否使用粗造型RB51疫苗以防控布病，還應(yīng)考慮本地布病防控現(xiàn)狀。

4 小 結(jié)

隨著我國經(jīng)濟(jì)生活水平的日益提高，鹿群布病的流行傳播和危害已經(jīng)逐漸為人們所認(rèn)識(shí)并日益得到重視[29-30]。吉林省作為養(yǎng)鹿大省，人間布病患者中與養(yǎng)鹿相關(guān)占到1.17%-2.54%；新疆某馬鹿場，職工58%布病抗體檢測為陽性，鹿流產(chǎn)率達(dá)到20%。對于我國布病二類和三類地區(qū)，凈化布病的牛羊等家畜隨著轄區(qū)內(nèi)飼養(yǎng)或者野生鹿的引入其感染布病風(fēng)險(xiǎn)而逐漸增大。對于布病一類地區(qū)，牛羊等放養(yǎng)家畜布病防控的同時(shí)也不能忽略周邊野生鹿群布病感染的風(fēng)險(xiǎn)。雖然美國、加拿大等國家宣布家畜實(shí)現(xiàn)凈化布病狀態(tài)，但是其境內(nèi)的麋鹿、馬鹿等野生動(dòng)物布病一直對人類及家畜產(chǎn)生持久的威脅。

2021年，修訂的《中華人民共國和動(dòng)物防疫法》把野生動(dòng)物疫病防控提到一個(gè)新的高度。野生鹿群和捕獲后圈養(yǎng)鹿布病的防控也必將得到重視。世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)麋鹿、馬鹿感染豬種、牛種、羊種布魯氏菌。所以，摸清我國野生與圈養(yǎng)鹿布病基線，驗(yàn)證現(xiàn)有家畜布病血清學(xué)方法對鹿診斷的可靠性，預(yù)測野生鹿群布病發(fā)展趨勢，不但可以降低布病在野生動(dòng)物之間的循環(huán)，還可以減少鹿群對易感家畜和人傳播布病風(fēng)險(xiǎn)[31]。美國RB51疫苗對于防控野牛及麋鹿效果也不明顯。所以，我國應(yīng)準(zhǔn)備采用新的技術(shù)路線，著手研究有效控制野生鹿群布病疫情的疫苗，優(yōu)化免疫途徑與方法，系統(tǒng)評價(jià)現(xiàn)有布病活疫苗對圈養(yǎng)鹿群布病防控效果，以應(yīng)對我國鹿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和布病防控之間的矛盾。

世界目前尚無針對鹿布病防控的疫苗及其免疫程序。本文只是綜述了國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道鹿群布病疫苗免疫的情況。隨著我國鹿產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，我國大量飼養(yǎng)的馬鹿、梅花鹿等布病防控就成為一個(gè)熱點(diǎn)問題。此外，對于確實(shí)因?yàn)椴疾「腥径蕴穆梗胤秸芯看_定一個(gè)補(bǔ)償?shù)臉?biāo)準(zhǔn)，便于推進(jìn)感染布病鹿的撲殺等無害化處理。由于國內(nèi)一些鹿場已經(jīng)用家畜布病活疫苗免疫圈養(yǎng)鹿群進(jìn)行布病防控取得一定的效果，需要在國家層面對增加鹿這個(gè)靶動(dòng)物進(jìn)行安全性與有效性評價(jià)，科學(xué)指導(dǎo)鹿群布病防控工作，進(jìn)一步規(guī)范布病疫苗的科學(xué)使用。