張艷玲，孟慶玲*，喬 軍，任宏琪，趙春光，寧程程，季春暉，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046)

弓形蟲病是由專性胞內(nèi)寄生性原蟲弓形蟲感染機體所引起的人獸共患性疾病，對于免疫能力正常的成年人，弓形蟲侵染機體一般無明顯的臨床癥狀；當(dāng)機體免疫功能低下或有缺陷時，弓形蟲可侵害其各個組織器官引起嚴(yán)重的臨床癥狀，如弓形蟲腦炎、眼病和心肌心包炎等，嚴(yán)重時可危及生命。妊娠期婦女感染弓形蟲后可導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒畸形、死亡[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界健康人群弓形蟲的感染率在7.5%～80%。美國、北歐和東南亞的患病率低于30%，而在非洲和拉丁美洲地區(qū)超過60%[2-3]。我國不同地區(qū)人群感染率為0.3%～47.3%，平均可達(dá)7.88%。隨著我國寵物犬、貓的飼養(yǎng)量逐年增長，人類的感染情況也出現(xiàn)上升的趨勢，人弓形蟲抗體陽性率升至12.3%[4]?，F(xiàn)階段無可根治此病的藥物。因此，開展弓形蟲感染的檢測方法研究對于該病的有效防控具有重要意義。目前市場上大多數(shù)商業(yè)血清學(xué)檢測試劑盒使用的抗原是通過小鼠體內(nèi)或組織培養(yǎng)獲取的速殖子所制備的天然抗原，生產(chǎn)這些抗原的方法在不同的實驗室之間難以標(biāo)準(zhǔn)化[5-6]。重組抗原利用基因工程和分子生物學(xué)方法獲得重組抗原作為替代抗原來源，抗原成分確定，可選擇的抗原多種多樣，方法易標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)選擇的抗原，可以區(qū)分出急性感染和慢性感染兩個階段[7]。因此，本研究用基因工程方法獲得重組蛋白，以此作為抗原，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，制備了弓形蟲抗體檢測試紙條，用于弓形蟲病的診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、血清及試劑E.coliDH5α、E.coliBL21、pET32a(+)質(zhì)粒，均由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲實驗室保存，弓形蟲陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈；2×PCR Mix、核酸限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、Hind Ⅲ，均購自TaKaRa公司；DNA Marker、T4 DNA Ligase 蛋白Marker，購自北京全式金公司；蛋白上樣液和BSA，購自北京索萊寶公司；葡萄球菌A蛋白(SPA)、HPR兔抗犬IgG、兔抗犬IgG，均購自北京博爾西科技公司；膠體金溶液、金標(biāo)墊、樣品墊、硝酸纖維素膜(NC)、吸水墊、PVC底板，均購自上海金標(biāo)生物科技公司。

1.1.2 主要儀器 小型離心機(Eppendorf，SG-800)，PCR儀(TC4000)，電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-6)，穩(wěn)定穩(wěn)流電泳儀(DYY-6C)，瓊脂糖水平電泳液(DYCP-31DN)，丙烯酰胺凝膠電泳槽(DYCP-31DN)，高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3780)，恒溫?fù)u床(ZHWY-2102C)，水平搖床(Ts-2)，制冰機(Bio-Rad)，超凈工作臺(BHC-1300A/B3)，全波長酶標(biāo)儀(Thermo，MultiskanGO)，凝膠成像儀(Bio-Rad)，恒溫培養(yǎng)箱(HIQ-X100)。

1.2 方法

1.2.1 GRA11基因抗原表位集中片段的篩選及合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫獲悉弓形蟲ME49株GRA11基因和蛋白質(zhì)序列，通過ExPASy提供的程序ProtParam預(yù)測GRA11蛋白的分子質(zhì)量、等電點、氨基酸組成等理化性質(zhì)，在線預(yù)測跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)并通過DNASTAR軟件在線分析蛋白的抗原表位和二級結(jié)構(gòu)，選取無跨膜區(qū)且抗原表位集中一段基因序列人工合成。

1.2.2 GRA11基因的PCR擴增 根據(jù)篩選出的GRA11基因片段，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計一對引物，并在上、下游分別加入保護(hù)性堿基和限制性酶切位點KpnⅠ與HindⅢ，上游5′GGGTACCATGGCTCAGCCGGACAC3′,下游5′CCC AAGCTTTTACGGTTTCAGTTCGTCTT3′,引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。用PCR方法擴增目的片段，反應(yīng)體系(20 μL)：無菌去離子水9 μL，2×TaqMix 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的目的片段進(jìn)行膠回收處理。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 對膠回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a(+)分別進(jìn)行KpnⅠ與Hind Ⅲ雙酶切，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，加入T4 DNA連接酶4℃過夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切初步鑒定后送北京華大基因公司進(jìn)行測序。測序后將正確的質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-GRA11。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-GRA11轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐青霉素的LB平板上，挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)。分別收集誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h時的菌液。將菌液離心，分離上清和沉淀，重懸沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。以一抗為1∶200稀釋的犬弓形蟲陽性血清，二抗為1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗犬IgG，用Western blot方法進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)原性分析，最后DAB顯色拍照分析。

1.2.5 基于rGRA11膠體金的免疫層析方法的建立 取一排8孔可拆卸酶標(biāo)板板條，每孔中加入200 μL的膠體金溶液，依次加入0.1 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。加入過量標(biāo)記的SPA 20 μL，混勻室溫靜置10 min后加入100 g/L NaCl，每孔50 μL，充分混勻后靜置20 min后用酶標(biāo)儀檢測OD525nm對應(yīng)的數(shù)值，數(shù)值變化最小的管對應(yīng)的pH確定為最佳標(biāo)記pH；取一排8孔可拆卸酶標(biāo)板板條，每孔加入200 μL膠體金溶液，調(diào)節(jié)至最佳pH后依次加入0.25、0.5、1.0、1.25、1.5、1.75、2 μg/mL的SPA，混勻后室溫靜置20 min，每管加入50 μL 100 g/L NaCl，混勻后室溫靜置20 min后，用酶標(biāo)儀檢測OD525nm對應(yīng)的數(shù)值，數(shù)值變化最小的管對應(yīng)的SPA 濃度確定為最佳蛋白標(biāo)記量。參考楊升[8]文中方法制備金標(biāo)液。然后選取硝酸纖維素膜，T線和C線分別用不同濃度的純化的rGRA11蛋白包被和兔抗犬IgG包被，確定T線和C線最佳包被濃度。最后取出粘性底板PVC(聚乙烯氯化物)板，依次粘貼NC膜-吸水紙-金標(biāo)墊-樣品墊。NC膜位于PVC底板中央最底層，吸水紙位于PVC板上沿，吸水紙下沿覆蓋NC膜；結(jié)合墊上沿覆蓋NC膜1 mm～2 mm，樣品墊上沿覆蓋金標(biāo)墊2 mm，下沿與 PVC板的下沿齊平，組裝試紙條。

1.2.6 敏感性與特異性試驗 將弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024進(jìn)行倍比稀釋后，取100 μL梯度稀釋的陽性血清依次滴于同一批次的9個試紙條的樣品檢測端，確定檢測出弓形蟲病陽性血清的最高稀釋度，從而確定其敏感性。

取新孢子蟲(Nc)陽性血清、肝片吸蟲(Fh)陽性血清、犬瘟熱病毒(CDV)陽性血清、弓形蟲(Tg)陽性血清，滴于所制備的同一批次試紙條檢測端，3 min后觀察檢測結(jié)果，分析該方法的特異性。

1.2.7 符合性試驗 用上述建立的rGRA11膠體金的免疫層析方法與商品化弓形蟲間接血凝抗體檢測試劑盒對119份犬臨床血清樣品進(jìn)行檢測，分析所建立rGRA11膠體金的免疫層析方法的特異性和敏感性以及與商品化弓形蟲間接血凝抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲GRA11基因合成與鑒定

PCR擴增結(jié)果顯示，GRA11基因擴增產(chǎn)物在501 bp處有一條清晰的目的條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符(圖1)，證實成功得到了GRA11基因。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～2.GRA11基因擴增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-GRA11雙酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET-32a(+)-GRA11經(jīng)KpnⅠ與Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到約5 900 bp的載體片段和501 bp目的片段(圖2)，與預(yù)期片段大小一致，證實GRA11基因已插入到pET-32a(+)載體中。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1～3.重組質(zhì)粒pET-32a(+)-GRA11雙酶切

2.3 重組蛋白rGRA11的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)后重組菌在36 ku處表達(dá)出了與預(yù)期蛋白大小相符的蛋白，而上清液中未檢測到蛋白條帶，證明rGRA11主要以包涵體的形式表達(dá)(圖3)。經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，Western blot分析在約36 ku處檢測到目的條帶(圖3)，證明表達(dá)的rGRA11能夠與犬弓形蟲陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

2.4 膠體金溶液最佳標(biāo)記pH與最佳蛋白標(biāo)記濃度

用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)每管膠體金溶液pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每管再加入SPA蛋白和NaCl溶液反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測定每管膠體金溶液所對應(yīng)的OD值分別為0.452、1.059、0.990、0.342、0.351、0.358、0.362、0.375，結(jié)果顯示pH為6.5時OD525nm數(shù)值變化最小，所以膠體金溶液最佳標(biāo)記pH應(yīng)為6.5。將每管膠體金溶液pH調(diào)至最佳，再于每管分別加入0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mg/mL不同稀釋濃度的SPA蛋白和NaCl溶液反應(yīng)后，測定每管膠體金溶液所對應(yīng)的OD值分別為0.556、0.979、0.999、1.231、0.896、0.821、0.652、0.599，結(jié)果顯示當(dāng)加入的SPA濃度為0.75 mg/mL時OD525nm數(shù)值變化最小。所以膠體金溶液最佳蛋白標(biāo)記濃度應(yīng)為0.75 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～4.重組菌誘導(dǎo)0、2、4、6 h; 5.重組蛋白rGRA11的Western blot鑒定

2.5 最佳檢測線和質(zhì)控線質(zhì)量濃度的確定結(jié)果

用1.5、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL梯度濃度的rGRA11在NC 膜檢測線(T 線)處劃線，用0.75、0.65、0.5、0.25、0.1 mg/mL在兔抗犬IgG在NC膜控制線(C線)處劃線，當(dāng)T線包被的蛋白濃度為1 mg/mL 時條帶條帶顏色明顯且蛋白濃度最低，當(dāng)C線包被的抗體濃度濃度為0.75 mg/mL時，條帶顏色明顯且抗體使用濃度最低(圖4)。所以，膠體金試紙條的T線、C線最佳蛋白標(biāo)記濃度分別為1 mg/mL和0.75 mg/mL。

2.6 敏感性與特異性試驗

將犬弓形蟲陽性標(biāo)準(zhǔn)血清倍比稀釋至1∶1024，用同一批次的膠體金試紙條進(jìn)行敏感性試驗。當(dāng)稀釋至1∶512時仍可看到T線有輕微的條帶，所以試紙條的敏感性為1∶512(圖5)。

用同一批次的膠體金試紙條對Tg陽性標(biāo)準(zhǔn)血清、Nc陽性標(biāo)準(zhǔn)血清、Fh標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和CDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行檢測。Tg陽性標(biāo)準(zhǔn)血清T、C線均顯色；Nc、Fh、CDV陽性標(biāo)準(zhǔn)血清T不顯色，C線有顏色變化，表明試紙條特異性良好(圖6)。

圖4 檢測線(T)質(zhì)控線(C)抗體包被濃度的確定

2.7 臨床血清樣品的檢測對比試驗

用建立的rGRA11膠體金的免疫層析方法與商品化弓形蟲間接血凝抗體檢測試劑盒對119份犬臨床血清樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示rGRA11膠體金的免疫層析方法檢出陽性血清13份，商品化試劑盒檢出陽性血清16份。rGRA11膠體金的免疫層析方法的敏感性=100.00%[13/(13+3)]=81.25 %，特異性=100.00%[103/(103+0)]=100%，兩種檢測方法的符合率為100%[(13+103)/(13+0+3+103)]=97.4%，表明該試紙條的準(zhǔn)確性較高。

圖5 膠體金試紙條的敏感性試驗

圖6 膠體金試紙條的特異性試驗

3 討論

弓形蟲具有棒狀體、微線體和致密顆粒三大細(xì)胞器，三者在弓形蟲進(jìn)入機體后定植時分泌一系列蛋白，提供營養(yǎng)物質(zhì)和協(xié)助完成免疫逃避[9]。致密顆粒蛋白(GRAs)大多于弓形蟲速殖子和緩殖子時期均可表達(dá)，可以抵抗宿主細(xì)胞溶酶體對弓形蟲的攻擊，在寄生性納蟲液泡(PV)的形成和成熟起著重要的作用[10-11]。同時，GRAs是一種具有良好抗原性的分泌蛋白，可以作為弓形蟲感染診斷和疫苗研發(fā)的抗原。

近年來，弓形蟲幾十種蛋白基因被克隆到細(xì)菌和真核表達(dá)系統(tǒng)，包括表面抗原SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、SAG3 (P43)；致密顆粒蛋白抗原GRA1 (P24)、GRA2 (P28) 、GRA6 (P32)、GRA7 (P29)；棒狀體抗原ROP1 (P66)、ROP2 (P54)[12]等。以大腸埃希氏菌為載體誘導(dǎo)表達(dá)的GRA7重組蛋白建立ELISA方法，通過檢測了72份血清，其敏感性為68.9%[13]；以GRA2重組蛋白為抗原，建立ELISA方法檢測了90份血清，敏感性為22.5%；建立GRA6和P35重組蛋白作為抗原的ELISA，檢測57份血清中的IgG抗體，其敏感性分別為63.1%和54.5%；用純化后的弓形蟲表面抗原 SAG3 作為包被抗原對臨床中96 份貓血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果與商品化間接血凝試劑盒進(jìn)行對比，間接ELISA陽性率為61.46%(59/96)，間接血凝試劑盒的陽性率為56.25%(54/96)[14]；以P30作為檢測抗原，制備出膠體金試紙條，分別用試紙條和己建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測64份小鼠血清中的抗原，符合率達(dá)到93.8%[15]?？梢钥闯鏊鶚?gòu)建檢測方法特異性與敏感性參差不齊，這主要取決于所包被的重組抗原。因此，開發(fā)更多標(biāo)準(zhǔn)化的純化抗原尤為重要。

本研究前期對GRA11蛋白的結(jié)構(gòu)、理化特性和B細(xì)胞免疫原性進(jìn)行預(yù)測，通過抗原表位分析后，選取抗原表位高的基因序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，構(gòu)建載體用時少，成本低，并成功誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。在成功的獲得了高表達(dá)量的重組蛋白后，以純化后的重組蛋白作為包被抗原，制備出免疫膠體金檢測試紙條，通過檢測臨床上119份犬血清，并與市售的間接血凝檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行對比后，敏感性為81.25%，特異性為100%，兩種方法的符合率達(dá)到97.4%。