朱 鑫，冉丹丹*，湯 承，岳 華

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都 610041)

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA binding protein，CIRP)又稱為A18 hnRNP，屬于RNA結(jié)合蛋白中的核內(nèi)異質(zhì)核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族，是一種在脊柱動物的組織器官內(nèi)廣泛存在且表達高度保守的蛋白。近年來，CIRP作為研究重點，其許多功能被相繼證實，如人們發(fā)現(xiàn)CIRP除了在低溫(29℃)刺激下表達明顯增高外，還能被其他應(yīng)激條件如缺氧、紫外線等誘導(dǎo)而過量表達，并對細胞在上述應(yīng)激條件下起到保護作用[1-3]。在絲裂原活化蛋白激酶信號通路 (MAPK/ERK)和核因子κB信號通路(NF-κB)的調(diào)控中均有CIRP的參與，其中MAPK信號通路中的ERK1/2途徑在調(diào)節(jié)細胞增殖過程當中起關(guān)鍵性作用[4-5]，CIRP還能參與調(diào)節(jié)細胞的基本功能，包含細胞增殖和凋亡、細胞周期以及細胞骨架等過程[6-8]。

CIRP作為一個多功能蛋白，對作為生命最基本單位的細胞發(fā)育過程有重要的作用。在試驗細胞進行H2O2處理過程中，CIRP表達下調(diào)加重細胞凋亡，CIRP對心臟氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡具有保護作用[9],CIRP可能參與SISAP引起的早期肝損傷的病理進程[10]。在雄性小鼠未成熟的精細胞中，CIRP通過與雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B(Dyrk1b)相互作用來調(diào)節(jié)一些蛋白的磷酸化水平，從而促進未分化精原細胞的增殖。本試驗通過對CIRP過表達的乳倉鼠腎細胞(BHK-21)進行研究，探索CIRP對BHK-21細胞增殖情況的影響，為研究CIRP的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 CIRP穩(wěn)定過表達及敲低CIRP的BHK-21細胞系由西南民族大學動物醫(yī)學四川省重點實驗室構(gòu)建[11]及保存；CIRP過表達的BHK-21標記為BHK-21-Cirp，CIRP敲低的標記為BHK-21-ShCirp，只含有綠熒光報告載體的標記為BHK-21-GFP。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶，美國Hyclone公司產(chǎn)品；碘化丙啶，美國Sigma公司產(chǎn)品；伊紅染液、蘇木素染液，常德比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品。高速冷凍離心機(centrifuge 5804)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Casy TT細胞計數(shù)儀，瑞士Roche公司產(chǎn)品；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡S-4800，日本Hitachi公司產(chǎn)品；流式細胞儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細胞系 由本實驗室構(gòu)建Cirp過表達BHK-21細胞系后，經(jīng)過8次左右的傳代培養(yǎng)，BHK-21細胞的形態(tài)發(fā)生變化，將其標記為BHK-21-Cirp△。HE染色法觀察BHK-21細胞的形態(tài)，掃描電鏡觀察比較BHK-21的形態(tài)，細胞樣品經(jīng)過清洗、固定、梯度脫水、干燥和鍍金后置于掃描電鏡下觀察，用數(shù)碼成像系統(tǒng)采集適當?shù)臉悠穲D像。

1.2.2 BHK-21細胞生長曲線的繪制及比生長速率的計算 用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分別與BHK-21-GFP進行比較。第1組為BHK-21-Cirp△和BHK-21-GFP，第2組為BHK-21-ShCirp和BHK-21-GFP。將在25 cm2培養(yǎng)瓶中生長良好的BHK-21細胞消化制成懸液，按照Casy TT細胞計數(shù)儀的使用方法進行細胞計數(shù)。 第1組的細胞起始濃度為3.2×105個/mL，第2組的細胞起始濃度為5.2×105個/mL，將其接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基，每孔終體積為2.5 mL。將細胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察細胞生長情況。以24 h為一個時間間隔，每次取3個孔的細胞，用胰蛋白酶消化后進行細胞計數(shù)及記錄數(shù)據(jù)。

(1)

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測比較BHK-21的細胞周期 將生長狀態(tài)良好的BHK-21-Cirp△、BHK-21-GFP、BHK-21-ShCirp用胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，收集后經(jīng)過清洗、固定，用含2.5 ml/L Triton X-100的PBS處理細胞5 min，用PBS清洗后加入1mL濃度為50 μg/mL 的碘化丙啶(PI)重懸細胞，室溫染色30 min。上機檢測前用300目濾網(wǎng)將樣品過濾。

2 結(jié)果

2.1 BHK-21細胞形態(tài)的變化

經(jīng)過反復(fù)凍存和復(fù)蘇，按照上述培養(yǎng)細胞的方法傳代培養(yǎng)至第8代左右時，BHK-21的細胞形態(tài)由原本的梭形逐漸變?yōu)榱藞A形，將其標記為BHK-21-Cirp△(圖1),圖1中A、B、C為相鄰3代BHK-21細胞8 h的生長情況，可見每傳1代，形態(tài)變圓的細胞數(shù)量就越多；D、E、F為A、B、C對應(yīng)代次細胞24 h后的生長情況，也可清晰觀察到細胞變圓的過程。

圖1 BHK-21細胞形態(tài)的變化過程(100×)

HE染色結(jié)果見圖2。由于漂洗原因，細胞核被蘇木精染成了明顯的藍色或淺藍色，細胞質(zhì)被伊紅染成了粉紅色，部分接近紫色。染色結(jié)果可見BHK-21變形細胞的細胞核明顯增大，且大小不一，整個細胞呈飽滿狀，核質(zhì)比顯著高于正常形態(tài)的細胞。BHK-21正常細胞的細胞核較小，且大小均一，細胞呈細長狀。

圖2 BHK-21細胞HE染色結(jié)果(200×)

圖3中D、E、F分別為BHK-21正常形態(tài)在1 000×、2 000×、3 000×的形貌，細胞呈梭形，扁平狀，表面較為光滑，細胞表面只具有較少的微絨毛，無泡狀物；圖3A、B、C分別為BHK-21異常形態(tài)在1 000×、2 000×、3 000×的形貌，細胞呈圓形，且飽滿，表面不光滑，其中B和C可見細胞周圍具有大量的偽足和泡狀物，細胞由梭形變?yōu)榱瞬灰?guī)則的圓形，細胞表面極不光滑，周圍具有較多泡狀物，每個細胞幾乎都有許多長且發(fā)達的偽足，這些偽足從細胞膜邊緣伸出到無細胞區(qū)域，有的與鄰近細胞的偽足相互緊密連接或嵌合。

圖3 掃描電鏡觀察結(jié)果

2.2 CIRP促進了BHK-21細胞的增殖

圖4 BHK-21-CIRP和BHK-21-GFP的細胞形態(tài)(100×)

圖5 BHK-21細胞的增殖曲線

2.3 CIRP對BHK-21細胞周期的影響

細胞周期共包含靜止期/DNA合成前期(G0-1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。經(jīng)過乙醇固定，Triton X-100處理，PI對DNA進行染色后，使用流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果顯示，BHK-21-Cirp△(A)、BHK-21-GFP(B)、BHK-21-ShCirp(C)處于G0-1期的DNA含量比例(即細胞數(shù)量比)依次為52.4%、55.3%和66.7%，處于S期的DNA含量比例依次為26.1%、24.7%和19.7%(圖6)，說明在其他條件相同的情況下，CIRP能夠促進BHK-21細胞提前進入S期，加快了細胞周期的進程，從而促進BHK-21細胞的增殖。

3 討論

本試驗經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)CIRP過表達的BHK-21細胞，發(fā)現(xiàn)BHK-21細胞的形態(tài)變?yōu)閳A形。隨后采用HE染色法觀察了其細胞核與細胞質(zhì)的變化，并用掃描電鏡觀察對比了BHK-21的細胞形態(tài)。根據(jù)HE染色結(jié)果顯示，變圓的BHK-21細胞的細胞核明顯增大，且大小不一，核質(zhì)比顯著高于正常形態(tài)的細胞，生長速度明顯加快。用掃描電鏡觀察BHK-21的細胞形態(tài)能夠更加清晰且直觀的看到變圓的BHK-21細胞具有大量發(fā)達的偽足。偽足結(jié)構(gòu)是區(qū)別于正常細胞的明顯特征，并且在腫瘤細胞中，偽足也是其活躍的運動力和侵襲力的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，偽足對腫瘤細胞黏附、侵襲、運動、支撐、營養(yǎng)攝取等過程有關(guān)鍵性的作用[12-14]。因此，推測CIRP過表達使BHK-21細胞突變?yōu)槟[瘤細胞。

圖6 BHK-21細胞周期的檢測結(jié)果

細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經(jīng)歷的全部過程。作為細胞活動最基本的過程，對細胞增殖的影響至關(guān)重要。在細胞周期的4個階段都有相應(yīng)的細胞周期蛋白、細胞周期依賴激酶(CDK)和細胞周期依賴激酶抑制劑進行協(xié)作控制。研究發(fā)現(xiàn)，CIRP的過表達可以調(diào)控小鼠胚胎成纖維細胞中ERK信號通路，激活細胞周期蛋白cyclin D1、S4等蛋白的合成，加快細胞周期的前進，最終達到促進細胞增殖的作用。過表達的CIRP通過與雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B(Dyrk1b)互作，調(diào)節(jié)cyclin D1蛋白和p27蛋白的磷酸化水平以及Dyrk1b與p27的結(jié)合來促進未分化的精原細胞的增殖作用[15]。CIRP能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白來加快細胞周期的進程，促進細胞增殖。本試驗用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分別與BHK-21-GFP進行比較，通過繪制其增殖曲線，計算比生長速率，以及采用流式細胞儀檢測其細胞周期，證實了CIRP過表達能夠促進BHK-21細胞從G0-G1期進入S期，加快細胞周期的進程，最終達到促進細胞增殖的作用。因此，推測CIRP能夠通過與細胞周期蛋白相互作用或者調(diào)節(jié)細胞周期蛋白活性，從而調(diào)控細胞周期的進程，最后促進細胞增殖。

本試驗經(jīng)過連續(xù)傳代發(fā)現(xiàn)BHK-21細胞的形態(tài)發(fā)生了變化，并對其細胞形態(tài)進行了觀察和比較，推測CIRP過表達使其突變?yōu)槟[瘤細胞。證實了CIRP過表達能夠通過加快BHK-21的細胞周期，從而促進BHK-21細胞的增殖，為深入研究CIRP對細胞生長發(fā)育的作用提供參考。