拉巴次旦，紀(jì) 鵬，趙年壽，吳金措姆*，馬興斌，四朗玉珍，班旦，格桑卓嘎

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

苦參堿類生物堿廣泛存在于豆科槐屬藥用植物中，如苦參、苦豆子、山豆根和砂生槐；苦參堿類生物堿中的單體成分主要有氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和槐定堿等成分，這些成分具有廣泛的生物活性，如抗病毒、抗寄生蟲、消炎、抑菌、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、調(diào)節(jié)心血管機(jī)能等[1]，因此具有較好的獸藥應(yīng)用開發(fā)前景。 為篩選出苦參堿類生物堿成分的高效提取純化方案，本文主要對(duì)苦參堿類生物堿成分的提取方法、工藝優(yōu)化及純化方法的相關(guān)研究進(jìn)行了回顧分析，為獲取高提取量和高純度的苦參堿類生物堿的研究提供參考。

1 苦參堿類生物堿的提取方法

傳統(tǒng)生物堿的提取方法主要有水提、醇提、酸水提、浸漬、滲漉、煎煮和回流提取法，這些方法獲取生物堿含量較低且純度不高；通過對(duì)苦參堿類生物堿提取技術(shù)的深入研究，超聲輔助提取、微波輔助提取、雙水相萃取、加速溶劑、分子印跡技術(shù)、高效液相色譜等方法應(yīng)用而生，因其便捷、高效、快速等優(yōu)勢(shì)，在苦參類生物堿的提取分離過程中得到了更加廣泛的應(yīng)用[2]；為了能更加有效的利用苦參堿類生物堿成分的利用度及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)對(duì)苦參堿類生物堿提取方法進(jìn)行梳理。

1.1 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法主要通過機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)使中藥中的成分更有利于溶解和釋放。運(yùn)用超聲波輔助提取方法能節(jié)省時(shí)間、降低成本、獲取高提取率等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于與非超聲的傳統(tǒng)水提方法，使苦參堿提取率從0.213%提高到0.472%，說明該方法能顯著提高生物堿的提取率。

1.2 雙水相萃取法

雙水相萃取法是一種易于放大、可連續(xù)化操作的液/液萃取分離技術(shù)，在天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域應(yīng)用較多。用乙醇/硫酸銨構(gòu)建雙水相體系，能更加穩(wěn)定、獲得的萃取率更高。用該方法能獲取更多的苦參堿類生物堿含量，適合大規(guī)模提取苦參堿類生物堿。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法因其工藝簡(jiǎn)便、受熱均勻等特點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。用密閉微波輔助、聚焦微波輔助、微波輻射-溶劑回流提取法對(duì)氧化苦參堿和苦參堿含量的影響進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法比常規(guī)回流提取法有更高的提取效率，在作用時(shí)間和強(qiáng)度上有明顯優(yōu)勢(shì)；用冷浸、加熱回流、超聲提取、密閉微波輔助提取法研究對(duì)苦參生物堿的影響，發(fā)現(xiàn)密閉微波輔助提取法效果最好，獲取氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿的含量分別為12.527、1.422、1.083、4.163、0.758 mg/g。比回流提取法及其他傳統(tǒng)提取法的提取效率更高。

1.4 超聲波-微波協(xié)同萃取法

超聲波-微波協(xié)同萃取法是一種微波與超聲波協(xié)同的提取技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)兩者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，但是目前應(yīng)用較少。用該方法提取苦豆子中的氧化苦參堿，發(fā)現(xiàn)在超聲提取條件下，以700 mL/L乙醇為提取溶劑、提取時(shí)間3 min、微波功率500 W、固液比1 g/mL∶15 g/mL時(shí)，可獲得更高的得率，其優(yōu)勢(shì)在于能比常壓回流提取法和其他單獨(dú)輔助提取法的提取率增加24.5%[3]?，F(xiàn)代提取方法的建立，在一定程度上能極大的節(jié)省提取時(shí)間，提高生物堿的提取率，尤其是以超聲波-微波協(xié)同萃取法的提取效率最為顯著。

2 苦參堿類生物堿的提取工藝優(yōu)化2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)工藝優(yōu)化

2.1.1 超聲波輔助提取正交優(yōu)化 以超聲波溫度、提取時(shí)間、超聲波頻率、超聲次數(shù)為變量，苦參堿、氧化苦參堿、苦參總堿為指標(biāo)，結(jié)合L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳優(yōu)化條件為：超聲頻率35 kHz、溫度50℃、提取時(shí)間32 min、提取次數(shù)為1次，可得到苦參堿和氧化苦參堿3.40%和2.71%[4]；采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到最佳優(yōu)化條件為：650 mL/L乙醇、料液比1∶20、超聲功率40%、提取溫度30℃，得到生物堿含量為0.104 mmol/g[5]；結(jié)合L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到優(yōu)化條件為：粒徑60目、650 mL/L乙醇、料液比1∶5、提取時(shí)間2 h[6];650 mL/L乙醇，料液比1∶16，溫度30℃，提取次數(shù)2次，提取時(shí)間20 min，提取率4.60%。以超聲波輔助為提取方法進(jìn)行的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化中，主要考察超聲頻率/功率、提取時(shí)間和溫度對(duì)生物堿提取量的影響，用優(yōu)化后的條件提取，能獲取更多的生物堿。

2.1.2 乙醇溶劑提取正交優(yōu)化 結(jié)合正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳工藝條件為：粒徑60目，15倍量700 mL/L乙醇，60℃加熱提取2次，每次提取1 h，該條件下得到氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿和槐果堿含量分別為80.10、19.60、9.26、3.92 μg/g[7]；以超聲波提取法研究乙醇、料液比、提取時(shí)間和次數(shù)單因素對(duì)生物堿含量的影響，結(jié)合L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，單因素中以乙醇濃度影響最顯著，最終優(yōu)化條件為：400 mL/L乙醇、料液比1∶20、提取時(shí)間1.5 h、提取2次，該條件下獲取總生物堿16.71 mg/g；通過溶劑HCl(10 mL/L)、乙醇(300、600、900 mL/L)對(duì)苦參的氧化苦參堿和苦參堿的含量進(jìn)行測(cè)定，篩選出最佳提取溶劑為600 mL/L乙醇，進(jìn)一步以料液比、提取時(shí)間和次數(shù)為考察因素，結(jié)合L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化氧化苦參堿和苦參堿含量，得到最佳優(yōu)化條件為：600 mL/L乙醇提取3次，加醇量為12、10、10倍，每次提取2 h；以650 mL/L乙醇作為提取溶劑，考察了料液比、浸泡時(shí)間、滲漉速度、粒度因素對(duì)6個(gè)地區(qū)苦參中的氧化苦參堿和苦參堿含量的影響，并結(jié)合L9(34)正交優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：粒度為粗粉、料液比1∶6、浸泡時(shí)間24 h、滲漉速度4 mL/min，得到最佳提取方法為滲漉法，其次為回流法[8]；為了進(jìn)一步優(yōu)化苦參葉中生物堿的提取工藝，考察變量乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)生物堿含量的影響，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在90℃水浴，料液比1∶25， 800 mL/L乙醇回流提取1次，提取時(shí)間2 h的條件下，獲得的苦參堿含量最高；由上述內(nèi)容可知，以乙醇作為提取溶劑的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化中，乙醇的濃度變化將直接影響生物堿含量的提取率，因此能否選擇適宜的乙醇濃度尤為關(guān)鍵，通過上述內(nèi)容可知，乙醇濃度最適的選擇范圍在400 mL/L～700 mL/L時(shí)，此時(shí)獲取的生物堿含量較高[9]。

2.1.3 酸水溶劑提取正交優(yōu)化 以酸水作為提取溶劑結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝的研究較少，以醋酸水為提取溶劑，以浸膏和苦參堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，考察酸水濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)生物堿含量影響，得到最佳提取工藝條件為：料液比為藥材的6倍量、20 mL/L酸水、提取2次、回流時(shí)間1 h，該條件下苦參堿浸膏率最高[10]。

2.1.4 快速溶劑萃取正交優(yōu)化 為了優(yōu)化山豆根中苦參堿和氧化苦參堿的最佳提取條件，對(duì)溫浸、超聲、回流、快速溶劑萃取方法進(jìn)行考察，得出快速溶劑萃取法為獲取苦參堿和氧化苦參堿的最佳方法，進(jìn)一步考察乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)生物堿含量的影響，結(jié)合L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)快速溶劑萃取法進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件為：乙醇濃度400 mL/L、溫度90℃、提取時(shí)間13 min、提取次數(shù)2次?？焖偃軇┹腿》ㄗ鳛橐环N新的提取方法，與其他提取方法相比較，具有顯著優(yōu)勢(shì)，如提取成本低、省時(shí)、高效等。

2.1.5 乳膏劑制備及乳膏劑基質(zhì)正交優(yōu)化 正交設(shè)計(jì)作為一種線性模型優(yōu)化設(shè)計(jì)方法，可以篩選出不同因素水平的最佳組合，但其只能分析離散型數(shù)據(jù)。在正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝中，提取溶劑主要以乙醇為主，提取方法主要以超聲波提取為主，通過對(duì)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的溶劑濃度、粒徑大小、料液比、提取時(shí)間和溫度等因素進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙醇的濃度變化能直接決定生物堿的含量，用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)苡行ШY選出不同因素水平之間的最佳組合，進(jìn)一步提高了苦參堿類生物堿的提取率[11]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 乙醇溶劑響應(yīng)面優(yōu)化 有研究檢測(cè)了乙醇、料液比、超聲時(shí)間對(duì)苦豆子生物堿含量的影響，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳優(yōu)化條件為：650 mL/L乙醇、料液比1∶8、提取時(shí)間30 min，該條件下得到生物堿29.1 mg/g[12]；從超聲、回流和水提法中篩選出以乙醇為溶劑的回流提取法提取生物堿，每次提取2次，并以乙醇、料液比、提取時(shí)間為變量，將氧化苦參堿、苦參堿、總生物堿和浸膏率“歸一值”為指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳優(yōu)化條件為：650 mL/L乙醇、料液比1∶10、提取時(shí)間2 h，該條件下得到氧化苦參堿、苦參堿、總生物堿和浸膏率的含量分別為0.914%、0.228%、1.719%和16.73%[13]；粒徑大小、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)總生物堿的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳優(yōu)化提取條件為：粒徑50 目、料液比1∶18.85、提取時(shí)間1 h、乙醇濃度88.9%，該條件下得到總生物堿12.59 mg/g[14]；以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為單因素，以氧化苦參堿、苦參堿和干膏率為指標(biāo)，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法對(duì)苦參堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得到最佳優(yōu)化條件為：650 mL/L乙醇、料液比1∶11、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間65 min。在響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)中，多選用乙醇作為提取溶劑，考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間變量對(duì)生物堿含量的影響為主，從最佳的提取條件中可知，該方法雖然能獲取較高含量的生物堿，但是還需要解決提取時(shí)間較長(zhǎng)和耗材較高等問題。

2.2.2 鹽酸溶劑響應(yīng)面優(yōu)化 以鹽酸作為提取溶劑結(jié)合響應(yīng)面分析，開展提取工藝優(yōu)化的研究較少，6 mL/L鹽酸、料液比1∶16、超聲功率300 W、提取時(shí)間33 min，該條件下獲得生物堿3.72%。響應(yīng)面設(shè)計(jì)最多選用乙醇作為提取溶劑，提取方法中主要以超聲法為主。響應(yīng)面分析法采用非線性模型設(shè)計(jì)，依托高精度的回歸方程來(lái)進(jìn)行篩選，可以篩選出不同因素水平的最佳組合，因此能更進(jìn)一步提高苦參堿類生物堿的提取率。

2.3 雙水相萃取工藝優(yōu)化

乙醇380 mL/L、硫酸銨180 g/L、pH7.0、萃取溫度30℃、萃取時(shí)間15 min，該條件下得到氧化苦參堿和苦參堿含量分別為96.17%和95.74%。有研究建立了微波輔助雙水相萃取法對(duì)山豆根的生物堿進(jìn)行分離，研究粒徑、料液比、萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)生物堿提取量的影響，結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳優(yōu)化條件為：粒徑100目，料液比1∶75，萃取溫度90℃，萃取時(shí)間5 min[15]。通過將雙水相萃取工藝與超聲輔助相結(jié)合的方法不僅有利于生物堿含量的提取，更能極大的縮短提取時(shí)間。

2.4 方法篩選工藝優(yōu)化

麩炒品得到生物總堿含量最高為0.395 5 mg/g，酒炙品次之為0.343 8 mg/g[16]；用水-酸水煎煮、乙醇-堿性乙醇回流、乙醇-堿性氯仿超聲提取法對(duì)苦參總生物堿含量檢測(cè)，結(jié)果表明，堿性氯仿超聲提取法為提取生物堿的最佳方法，該方法獲得總生物堿24.29 mg/g，其次為乙醇回流提取法(23.58 mg/g)[17]。麩炒炮制后可以提高生物堿含量，堿性氯仿超聲提取、吸附澄清法能在一定程度上獲得更高的苦參堿類生物堿含量。

3 苦參堿類生物堿的常見純化方法

3.1 大孔吸附樹脂純化

大孔吸附樹脂純化的原理是依靠范德華力吸附有機(jī)物，或依靠氫鍵形成半化學(xué)吸附，兼具分子篩效果，最終對(duì)有機(jī)物進(jìn)行選擇性吸附，不受無(wú)機(jī)鹽干擾。苦參堿類生物堿屬于吡啶類生物堿，常用的樹脂填充物為H103、AB-8、SP825、X-5等。結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)X-5型大孔樹脂的吸附參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在上柱流速為1.65 BV/h、pH為11.30、NaCl濃度2.45 mol/L條件下，得到苦參生物堿動(dòng)態(tài)吸附量實(shí)測(cè)值為8.29 mg/mL[18]；非極性樹脂BS-67-3的洗脫效果最佳，吸附率高達(dá)97.36，以吸附液pH為9、乙醇洗脫液濃度為2.0 mg/mL～2.5 mg/mL、氯化鈉樣品濃度為1.0 mol/L、樹脂重量與樣品體積比為1∶3、以3倍樣品體積的300 mL/L乙醇洗脫，再用3倍樣品體積700 mL/L乙醇洗脫后得到生物堿的提取率為97%，純度高達(dá)60%以上[19]；用D101型大樹脂，以上樣質(zhì)量濃度0.8 g/mL、上樣流速2 BV/h、700 mL/L乙醇洗脫劑、4 BV/h流速進(jìn)行洗脫，最終獲得的總生物堿純度高達(dá)66.83%[20]。由此可見，采用大孔樹脂對(duì)生物堿的純度進(jìn)行處理后能有效的提高生物堿純度，也是目前生物堿純化應(yīng)用較為廣泛的方法之一。

3.2 分子印跡技術(shù)

有研究建立了能夠快速進(jìn)行同步提取、分離和鑒定砂生槐生物堿的雙模板分子印跡固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(MISPE-HPLC-MS/MS)法，能得到氧化苦參堿3 793.88 μg/g和苦參堿含量1 828.25 μg/g[21]。制備熱敏型MT分子印跡聚合物，用于分離苦參堿，可顯著提高苦參堿的特異性吸附及提取效率[22]。分子印跡技術(shù)是集高分子化學(xué)、材料科學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科的一種新型中藥活性成分純化技術(shù)，具有預(yù)定性和特異識(shí)別性的優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

豆科槐屬植物中含有豐富的苦參堿類生物堿，這些生物堿成分具有廣闊的獸藥或獸用飼料添加劑開發(fā)前景，但目前針對(duì)苦參堿類生物堿的提取和純化的研究仍缺乏系統(tǒng)性，難以將其大規(guī)模的應(yīng)用到實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用過程中。因此，在后期研究中，將會(huì)進(jìn)一步對(duì)苦參堿類生物堿的提取工藝和提純工藝進(jìn)行更深入的研究，以便獲得更高效的苦參堿類生物堿提純方案，為獸藥或獸用飼料添加劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。