馮江浩，魏思昂，閆麗歡，崔 潔，馮 焱*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省太原市食品藥品檢驗所，山西太原 030000)

基因編輯技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的重要手段，通過對目的片段序列的改變，從而影響基因的功能。它的出現(xiàn)推進(jìn)分子生物學(xué)的進(jìn)程，提高了對于基因結(jié)構(gòu)功能的研究效率。目前基因編輯的主要手段有3種，包括鋅指核酸酶 (zinc finger endonuclease，ZFN)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)[1]。其中ZFN由于構(gòu)建繁瑣，逐漸被TALEN和CRISPR/Cas9所取代。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌中對于外源DNA的一種防御機(jī)制，主要功能是對外源侵入的噬菌體以及外源質(zhì)粒進(jìn)行切割，破壞DNA結(jié)構(gòu)，使其失去活性，無法轉(zhuǎn)錄以及翻譯蛋白對自身產(chǎn)生影響。CRISPR/Cas系統(tǒng)最早于1987年被發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列與噬菌體內(nèi)序列高度同源。Ⅱ型Cas9有核酸內(nèi)切酶活性[2]。在小鼠上實現(xiàn)基因編輯操作，將CRISPR/Cas9應(yīng)用于實際操作[3]。與TALEN相比，CRISPR/Cas9具有更加簡單的構(gòu)建過程和高效的剪切效率，但脫靶效應(yīng)也是限制其發(fā)展的核心問題之一。近年來CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)廣泛用于構(gòu)建動物模型以及細(xì)胞層面的研究。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成

1.1 CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)與分類

CRISPR/Cas系統(tǒng)依Cas蛋白的不同可分為2個大類，5個亞型[4]。其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ為第1類，Ⅱ、Ⅴ為第2類[10]。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為CRISPR序列和Cas蛋白，CRISPR序列是一段DNA序列，由多個重復(fù)的單元構(gòu)成，每個單元由一段長度為24 bp～48 bp的高度保守的重復(fù)序列和26 bp～72 bp的間隔序列組成，稱為簇狀短回文間隔重復(fù)序列[5]。間隔序列是與外源DNA同源的序列，通過轉(zhuǎn)錄CRISPR-derived RNA(crRNA)指導(dǎo)Cas蛋白對目的序列的匹配。另一個部分是Cas蛋白家族和crRNA與Trans-activting crRNA(trRNA)形成的復(fù)合體，Cas蛋白家族的基因序列位于CRISPR序列上游與之相鄰，每一個類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)所含的蛋白不同，功能亦不同。

1.2 CRISPR/Cas功能

CRISPR/Cas系統(tǒng)中CRISPR序列的功能是整合與指導(dǎo)作用，通過轉(zhuǎn)錄出crRNA指導(dǎo)Cas蛋白對目的序列進(jìn)行精準(zhǔn)切割。是一段與外源DNA同源的DNA序列，由Cas1、Cas2和Cas4將外源序列剪切后添加到CRISPR序列中。Cas蛋白是CRISPR/Cas系統(tǒng)中的功能運(yùn)行單位，不同Cas蛋白配合將外源DNA序列進(jìn)行處理，整合獲取外源序列信息，之后由具有DNA內(nèi)切酶活性的Cas蛋白對目的序列進(jìn)行切割，破壞外源DNA結(jié)構(gòu)達(dá)到防御目的，這一過程中需要CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的crRNA指導(dǎo)及trRNA的激活，形成有活性RNA-Cas蛋白復(fù)合體。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)運(yùn)行機(jī)制

CRISPR/Cas系統(tǒng)由于組成不同可分為外源DNA侵入與處理、前體crRNA轉(zhuǎn)錄加工和Cas蛋白識別切割三個階段。以Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)為例。首先是外源DNA侵入到細(xì)胞內(nèi)部并在細(xì)胞內(nèi)部展開，暴露出其DNA序列，之后4個Cas1與2個Cas2蛋白形成一個復(fù)合體，根據(jù)外源DNA的形狀不同附著其上進(jìn)行切割[6]。位置位于重復(fù)序列的5′端稱為原間隔序列的部位，形成一段短的DNA片段，此DNA片段會被插入到CRISPR序列的前端位于前導(dǎo)序列后的第1個重復(fù)序列上。第二步是CRISPR序列由RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄出前體crRNA[3]。此crRNA無活性，包含CRISPR序列啟動子后所有的重復(fù)序列與間隔序列單元。CRISPR序列中的重復(fù)序列會轉(zhuǎn)錄出于前體crRNA序列中互補(bǔ)的trRNA[7-8]。當(dāng)前體crRNA中的一個crRNA單元與互補(bǔ)的trRNA配對后同時與Cas9蛋白結(jié)合時由RNase Ⅲ對前體crRNA進(jìn)行切割形成具有活性的crRNA，一個完整的具有切割外源DNA活性crRNA-trRNA-Cas9復(fù)合體形成。第3步是Cas9蛋白復(fù)合體對外源DNA進(jìn)行切割，降解外源DNA，此過程是Cas9蛋白復(fù)合體對目的序列的識別。是由Cas9蛋白先對目標(biāo)DNA上的PAM序列進(jìn)行識別出匹配的protospacer adjacent motif(PAM)序列后由Cas9蛋白復(fù)合體內(nèi)的crRNA序列與PAM序列后長度約為23 bp的DNA序列的互補(bǔ)鏈進(jìn)行匹配。成功后Cas9蛋白的酶切活性區(qū)域在PAM序列的5′ 端進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂破壞DNA結(jié)構(gòu)完整性使外源DNA失活，完成一個完整的防御外源DNA過程。

3 CRISPR/Cas9缺陷及優(yōu)化

天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)十分復(fù)雜且過于龐大，第1類中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由于其中的Cas蛋白種類多，且識別與切割目的序列的部位于同一個Cas蛋白上，在應(yīng)用中不易操作，所以不常用于基因編輯處理，第2類中的Ⅱ、Ⅴ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白種類少，且識別與切割目的DNA序列的結(jié)構(gòu)都位于同一個Cas蛋白上，是實際應(yīng)用中的理想材料。

在基因編輯操作中只需要CRISPR/Cas系統(tǒng)中對于目的序列的識別與切割的能力，因此CRISPR序列就成為可去除的非必要部分，只保留能夠正常轉(zhuǎn)錄翻譯Cas9蛋白的DNA序列。在基因編輯操作中通常只有1到2個目標(biāo)位點，不需要CRISPR序列中完整龐大的多余序列，所以CRISPR序列可被人為轉(zhuǎn)錄的crRNA所代替，省略前體crRNA的處理步驟。此外，同過將trRNA與crRNA連接在同一條RNA鏈上形成單一的引導(dǎo)RNA (gRNA) 可進(jìn)一步簡化Cas9在實際應(yīng)用上的操作。常用的Cas9主要有從鏈膿桿菌 (Streptococcuspyogenes，spCas9)中獲得的spCas9和從金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus，saCas9) 中獲得的saCas9[8-9]。spCas9被廣泛應(yīng)用于動物的基因編輯操作，而saCas9因其序列較短更加適合由噬菌體攜帶，因此更適用于基因治療的研究。不同Cas9蛋白識別的PAM序列不同，根據(jù)使用要求，采用噬菌體共進(jìn)化的方法，產(chǎn)生多種spCas9的亞種可識別多種長度，序列不同的PAM序列[10]。進(jìn)一步擴(kuò)大Cas9可識別的DNA序列范圍，達(dá)到更加靈活的應(yīng)用。

dCas9是一種沒有DNA內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白變體。其可以同gRNA與DNA的匹配結(jié)合到目的序列上，但不能夠?qū)NA雙鏈進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂，可以額外連接上切割DNA雙鏈中一條鏈的酶，設(shè)計兩個切割位點，從而提高編輯精確程度。在動物試驗中，為了獲得正確的試驗體，對于切割靶點的選擇以及gRNA序列的設(shè)計，選擇合適的靶點以及gRNA設(shè)計是對于降低脫靶效率的關(guān)鍵步驟。對Cas9蛋白的不斷突變產(chǎn)生多種識別不同PAM序列的變體，一方面擴(kuò)展Cas9可識別的序列種類，也降低脫靶的可能性[11]。從Cas9蛋白入手將限制性內(nèi)切酶的Fok I區(qū)連接到無催化活性的Cas9 (dead Cas9，dCas9) 上，當(dāng)兩個dCas9形成二聚體才能切割形成DSBs，設(shè)計兩個gRNA靶點來切割一個位點，來降低脫靶效率[12]。用GAL4/UAS二元系統(tǒng)對CRISPR/Cas9進(jìn)行改造，使其可以在果蠅中組織特異性表達(dá)，增加CRISPR/Cas9的精準(zhǔn)性，降低脫靶可能帶來的危害。對于實驗體的脫靶檢測也是于設(shè)計相對應(yīng)的步驟，選擇合適的檢測手段，降低假陽性與假陰性的出現(xiàn)，提高檢測精準(zhǔn)度[13]。

4 CRISPR/Cas9應(yīng)用

4.1 研究領(lǐng)域應(yīng)用

4.1.1 基因敲入與敲除 CRISPR/Cas9系統(tǒng)最常用于基因敲除與敲入，對于某些基因位點的敲除效率能達(dá)到95%以上[14]。用Cas9蛋白作為DNA內(nèi)切酶靶向切割DNA序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)的同源重組(HDR)或非同源末端重組(NHEJ)將DSBs修復(fù)。HDR修復(fù)常用于Cas9基因編輯操作，可以根據(jù)人為提供的具有同源臂的模板進(jìn)行DBSs的修復(fù)，達(dá)到基因敲入的操作。設(shè)計兩條gRNA對目的序列上、下游進(jìn)行匹配達(dá)到基因定點敲除的操作。將Cas9基因連接上具有組織特異性表達(dá)的啟動子并整合到基因組中，可實現(xiàn)Cas9組織特異性的表達(dá)，達(dá)到具有組織特異性的切除目的DNA的能力[13]。對于某些致死基因的敲除可使用cre-LoxP系統(tǒng)制備條件性敲除的動物模型使目的基因在動物體內(nèi)有條件性地敲除保證個體存活[14-15]。條件性敲除需要的制備兩個LoxP插入位點的donor，在小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)雙donor效率要低于整合的單donor效率[16]。在基因序列中插入LoxP序列難度較大需要多次斷裂重組，在斑馬魚中實現(xiàn)了不需要HR的一步插入LoxP序列的方式。在敲入操作中同樣由于會有目的基因序列的插入需要制備donor，因此對于細(xì)胞的修復(fù)方式就更傾向于準(zhǔn)確性更高的HR修復(fù)[17]。在兔模型中敲入操作中HR修復(fù)促進(jìn)劑RS-1對提高插入成功率有顯著效果，而NHEJ抑制劑SCRP-7對于敲入成功率無顯著影響[18]。隨著更多的Cas蛋白的開發(fā)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)有了更多的功能，最常用的仍是其基本的敲入與敲除功能。

4.1.2 DNA單堿基突變 大多數(shù)基因編輯操作都是基于對DNA雙鏈切割形成DSBs后通過細(xì)胞內(nèi)修復(fù)方式進(jìn)行，這種方法可插入或去除較長的基因序列，對于單個核苷酸的突變需求操作過于繁瑣。Cas9的突變體dCas9由于人為突變失去了對DNA雙鏈切割形成DSBs的酶活性，將dCas9與胞苷脫氨酶混合后可將胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏亩纬蒀-T，G-A的突變達(dá)到點突變的效果，此方法不需要形成DNA雙鏈斷裂，降低錯配可能性，提高編輯效率。此外dCas13可對RNA進(jìn)行點突變，在不改變DNA序列的情況下對轉(zhuǎn)錄后修飾有很大的應(yīng)用空間。

4.1.3 表觀遺傳調(diào)控 表觀遺傳調(diào)控是不改變DNA序列而對性狀進(jìn)行調(diào)控，用dCas9突變失去切割DNA雙鏈的能力，保留對于目標(biāo)序列的識別能力，設(shè)計一段與轉(zhuǎn)錄啟動子等相關(guān)原件匹配的gRNA序列使dCas9能夠識別并結(jié)合在目標(biāo)位點上，同時可在dCas9上連接相應(yīng)的激活或抑制蛋白，達(dá)到激活或抑制目標(biāo)DNA的轉(zhuǎn)錄，以此來調(diào)控生物個體的性狀。

4.2 動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用

4.2.1 疾病模型構(gòu)建 用CRISPR/Cas9進(jìn)行動物疾病模型的構(gòu)建是基于其對基因的插入以及缺失的功能，構(gòu)建各種基因缺陷型的疾病模型來模擬各種情況。心腦血管疾病、糖尿病、肥胖等都可以用CRISPR/Cas9 進(jìn)行模型的構(gòu)建。CRISPR/Cas9能夠構(gòu)建的動物疾病模型類型多范圍廣，不論是小動物模型諸如小鼠、大鼠、斑馬魚等或是大動物模型如兔、豬等都可使用。從2013年成功用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠受精卵進(jìn)行編輯后，許多不同疾病模型相繼構(gòu)建成功[19-22]。近年來用CRISPR/Cas9 進(jìn)行模型構(gòu)建的技術(shù)趨于成熟，對疾病的發(fā)病機(jī)制有很大幫助。有研究成功構(gòu)建出肺鱗狀細(xì)胞癌的小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了免疫療法的試驗[23]。通過CRISPR/Cas9 在Notch3的第33個外顯子上插入了終止序列阻止其完整翻譯蛋白，致小鼠表現(xiàn)出腦膜側(cè)綜合癥的癥狀，并在大動物模型構(gòu)建方面成功構(gòu)建出豬的亨廷頓氏舞蹈癥模型，闡述了亨廷頓氏舞蹈癥模型中的神經(jīng)退行性變化[24]。

4.2.2 基因治療 基因治療的一個策略是使用腺病毒作為載體搭載Cas9系統(tǒng)的DNA，較為合適的是SaCas9蛋白。SaCas9蛋白的基因組序列很短約為3 300 bp，適合由經(jīng)過改造的腺病毒攜帶，注入到細(xì)胞內(nèi)部[25]。研究表明，用腺病毒攜帶saCas9蛋白基因，將其運(yùn)送到被人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的T細(xì)胞內(nèi)，對新產(chǎn)生的HIV進(jìn)行切割，阻止其繼續(xù)擴(kuò)散至其他細(xì)胞，有效降低HIV的擴(kuò)散，達(dá)到對HIV的抑制[26]。在人類胚胎中用CRISPR/Cas9修正了MYCBPC3基因的致病性突變解決了胚胎的遺傳性肥厚型心肌病[27]。通過對遺傳性酪氨酸血癥小鼠用注射的方式成功使小鼠的部分肝細(xì)胞表達(dá)Fah蛋白緩解了體重降低的現(xiàn)象[28]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腫瘤的免疫療法中的可行性已得到初步驗證，在非小細(xì)胞肺癌的免疫治療中，將患者自身的T細(xì)胞取出并用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PD-1基因后進(jìn)行擴(kuò)增，再注入患者體內(nèi)以達(dá)到抗腫瘤的目的[29]。