王爍程,張林波

(吉林農業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118)

隨著我國養(yǎng)豬量的不斷增加，豬群中疾病的流行情況也日趨復雜。腹瀉是豬群中比較常見的疾病，多發(fā)于冬季，主要癥狀是水樣腹瀉并伴有嘔吐，嚴重程度隨病豬的年齡變化而有差異，年齡越小，癥狀越嚴重，如今已成為世界范圍內的流行病。對于該病的病原學、免疫學等方面的研究，為該病的預防及檢測提供了新的思路。

1 豬α冠狀病毒簡介

冠狀病毒(Coronavirus)是自然界中較為常見一類RNA病毒，能夠感染哺乳動物腸道上皮細胞或呼吸道上皮細胞，且具有致命性。冠狀病毒最早發(fā)現于20世紀60年代，為禽類傳染性支氣管炎病毒，隨后又在人類普通感冒患者的鼻腔中發(fā)現人類冠狀病毒229E(HCoV-229E)以及人類冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)。

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)均為α冠狀病毒，屬于正義單鏈RNA病毒，基因組包含50個非翻譯區(qū)和至少7個開放閱讀框(open reading frame,ORF)，其中ORF1a和ORF1b占據病毒基因組的2/3，編碼2個非結構性復制酶多聚蛋白[1-2]，其余1/3則編碼結構蛋白，包括刺突糖蛋白(spike protein，S)，是一種跨膜糖蛋白，從病毒表面突出，其N端胞外域是受體結合位點，且含有主要的抗原決定簇；膜蛋白(membrane protein，M)含有3個跨膜結構域，主要功能是進行營養(yǎng)物質的跨膜運輸，并形成病毒外包膜；小包膜蛋白(envelope protein，E)是有離子通道活性的小疏水蛋白，能夠與包膜結合；核蛋白(nuclear protein，N)包裹RNA形成核衣殼，并且能夠誘導內質網應激，上調白細胞介素的表達。除此以外，少數冠狀病毒還含有血凝素酯酶[3-5]。

2014年，在美國俄亥俄州腹瀉仔豬的糞便中檢測到一種與豬α冠狀病毒基因組排列近似的冠狀病毒，命名豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)。PDCoV基因組除ORF1a、ORF1a、S、E、N外，還包含輔助蛋白6(accessory protein 6，NS6)、輔助蛋白7(NS7)和輔助蛋白7A(NS7a)。迄今，PDCoV僅在豬中被發(fā)現具有傳染性[6-7]。

2 豬α冠狀病毒感染的受體

病毒侵入宿主細胞起始于病毒與細胞受體的結合。目前認為，PEDV、TGEV等利用氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)作為與細胞結合的受體。APN是一種Ⅱ型細胞膜金屬蛋白酶，其存在于細胞表面，通過N端的胞質域與細胞連接，廣泛分布于成熟的小腸上皮細胞、小腸微絨毛表面等部位。APN能夠作為細胞因子、免疫調節(jié)劑、血管作用肽等物質的底物，在降低T細胞對MHCⅡ類分子-抗原肽的識別等方面發(fā)揮作用[8-10]。

APN糖基化區(qū)域存在動物物種差異，使其具有高度的物種特異性，如人類冠狀病毒無法以豬氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N，pAPN)作為細胞受體；TGEV能夠與純化的pAPN特異性結合，說明pAPN是TGEV的受體[11]。多項研究證明，pAPN在PEDV的感染中也發(fā)揮作用：①通過將表達pAPN的基因轉染到犬腎細胞(mardin darby canine kidney，MDCK)，使MDCK能夠表達pAPN，能夠被PEDV感染，且MDCK不是PEDV的易感細胞，說明pAPN能夠提升細胞對PEDV感染的敏感性；②采用病毒鋪覆蛋白結合試驗研究PEDV的受體，鑒定出一種150 ku的蛋白，是小腸上皮細胞和豬睪丸細胞的PEDV受體，使用抗pAPN抑制劑后，該蛋白與PEDV的結合被阻斷，說明該受體蛋白是pAPN；③表達pAPN的轉基因小鼠能夠被PEDV感染；④用pAPN抗體對細胞進行孵育后，接種PEDV時感染受到了干擾。然而近來的很多研究發(fā)現，pAPN可能不是PEDV感染的唯一受體：①通過使用外源表達并親和純化后的TGEV-S1和PEDV-S1蛋白，以流式細胞術分析兩種蛋白與pAPN的結合能力發(fā)現，TGEV-S1能夠與MDCK表達的pAPN結合而不與親代MDCK表面結合，但PEDV-S1并不與細胞表達的pAPN結合；②將豬睪丸細胞(swine testis，ST)細胞中的pAPN基因通過CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除后，發(fā)現基因敲除后ST細胞依然能夠被PEDV感染。此外，HeLa細胞也能夠被PEDV感染，但該感染過程并不需要pAPN作為受體[12]；③將豬小腸上皮細胞培養(yǎng)3 d后，pAPN的表達量僅達到了成熟豬小腸上皮細胞的約11%，說明培養(yǎng)3 d的細胞尚未完全成熟，培養(yǎng)7 d后pAPN的表達量有了明顯提高，且培養(yǎng)7 d的小腸上皮細胞對TGEV敏感性顯著高于培養(yǎng)3 d的，這與病毒主要感染并破壞小腸絨毛內襯的成熟小腸上皮細胞的情況相吻合，而PEDV的感染率卻沒有因為培養(yǎng)細胞的成熟出現明顯變化。通過分析衰老的小腸上皮細胞和經分化因子處理的小腸上皮細胞的pAPN表達量發(fā)現，以上兩種細胞均能表達較高水平的pAPN，增強其對PEDV感染的敏感性[13-14]。說明pAPN是PEDV感染的受體但并不唯一受體。PEDV是通過頂膜進入小腸上皮細胞的，除pANP外，其他分子在小腸上皮細胞分化過程中也于頂膜表達，如氫化可的松。氫化可的松在脂質、蛋白質等物質的代謝過程中具有重要作用，并且也是內皮細胞分化的關鍵因素，還能夠顯著上調人皮膚成纖維細胞中APN的表達，說明其也有可能是PEDV感染的另一受體[15]。

3 豬α冠狀病毒感染過程中與細胞免疫相關的重要物質

3.1 真核翻譯起始因子4-α

M蛋白是豬α冠狀病毒的結構蛋白，在病毒復制過程中具有重要作用，且該蛋白能夠用于特異性檢測和治療。M蛋白作為連接因子與高爾基體前區(qū)隔中的基因組RNA和核蛋白相互作用來啟動病毒顆粒的裝配。M蛋白的配體是真核翻譯起始因子4-α，將外源表達的GST-EIF4A2融合蛋白添加到含有相同濃度的GST-M蛋白的瓊脂糖微珠中，通過免疫共沉淀分析發(fā)現，EIF4A2和TGEV-M能夠在體外相互作用[16-18]。TGEV感染的細胞，通過間接免疫熒光試驗(IFA)發(fā)現，EIF4A2分布于細胞質和細胞核中，而M蛋白與EIF4A2在細胞質中出現部分重疊，說明在TGEV感染細胞中，EIF4A2與M蛋白存在相互作用。通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制宿主細胞EIF4A2表達，發(fā)現TGEV的復制受到了抑制，說明EIF4A2在TGEV的復制中發(fā)揮重要作用，該蛋白的發(fā)現有助于開發(fā)防控TGEV感染的新型制劑[19-20]。

3.2 膽固醇25-羥化酶和25-羥膽固醇

膽固醇25-羥化酶(cholesterol 25-hydroxylase，CH25H)是一種宿主細胞限制因子，能夠催化膽固醇被氧化為25-羥膽固醇(25-hydroxycholesterol，25HC)，而25HC在宿主抑制病毒感染中有重要作用[21]，該蛋白能夠抑制固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins ，SREBPs)。通常情況下，SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)與SREBPs在內質網中形成復合體。當合成固醇時，SREBP-SCAP在高爾基體中被位點1蛋白酶和位點2蛋白酶裂解為轉錄因子；當脂質過剩時，SCAP的構象發(fā)生變化，并與胰島素誘導基因結合(insulin-induced genes ，INSIGs)。25HC通過控制固醇生物合成過程中INSIGs的表達來增加內質網中的SREBP-SCAP復合體的含量[22]。因此，25HC被認為是固醇抑制劑。用構建的pCAGGS-CH25H重組質粒轉染非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)后，用PEDV感染Vero細胞發(fā)現，感染組N蛋白和mRNA表達水平明顯低于對照組。通過IFA分析發(fā)現，PEDV的復制被抑制，說明CH25H能夠抑制PEDV感染，且即使在CH25H酶活性較低的情況下，依然能夠抑制PEDV的復制。當用siRNA抑制CH25H表達時，PEDV N蛋白和mRNA表達水平都有所增加，通過測定TCID50發(fā)現，敲低CH25H會顯著提高病毒滴度，說明25HC和CH25H均對PEDV感染有抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴性。對感染YZ、MS、CV777、SH等4種PEDV毒株的Vero細胞使用25HC發(fā)現，25HC對4種毒株的復制均有抑制作用，說明25HC對PEDV的抑制具有廣譜性[23-24]。然而，25HC對抗PEDV感染的機制尚不明確，推測其可能是通過阻斷病毒進入宿主細胞的方式來抑制PEDV感染，并且對TGEV和PEDV感染均具有抑制作用。

4 豬α冠狀病毒的免疫逃逸機制

干擾素(IFN)介導的抗病毒反應是病毒與宿主相互作用的重要組成部分，在抗感染過程中發(fā)揮重要作用[25]。通常病毒侵入宿主細胞后，細胞的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR) 首先對其進行識別，而后誘導抗病毒反應，PRR的主要成分是維甲酸誘導基因-1樣受體，包括遺傳學和生理學實驗室蛋白2、黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation associated gene 5 ，MDA5)和維甲酸誘導基因-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ)。正常生理狀態(tài)下，RIG-Ⅰ通過N端的Caspase激活募集結構域與線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein ，MAVS)相互作用，處于自抑制狀態(tài)。RNA病毒感染后，產生的干擾素激活RIG-Ⅰ和MDA5。環(huán)指蛋白135通過K63蛋白釋放出RIG-Ⅰ自抑制所必須的E3連接酶，而MDA5通過CARD和MAVS的相互作用激活干擾素信號轉導途徑。在此過程中，MAVS激活絲氨酸激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)、腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2 ，TRAF2)，TRAF3，TRAF5和TRAF6。而后通過干擾素調節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和核轉錄因子κB(NF-κB)使TBK1進入細胞核，通過相應的信號轉導途徑產生包括IFN-β在內的主要抗病毒因子[25-26]。目前認為，不同冠狀病毒的N蛋白作為拮抗劑，通過靶向不同的信號蛋白介導RLR信號通路。如PEDV的N蛋白能夠螯合HEK293T細胞中TBK1-IRF3復合物，從而抑制IFN-β和核轉錄因子κB的活化。PDCoV的N蛋白也能夠抑制RIG-Ⅰ介導的IFN-β產生。PDCoV N蛋白可以直接靶向RIG-Ⅰ，并通過干擾K63阻斷其早期活化[27-28]。除N蛋白外，PDCoV的輔助蛋白NS6也是IFN-β的拮抗劑[29]。說明PDCoV N蛋白的作用機制與其他冠狀病毒不同，也說明了N蛋白在冠狀病毒感染、免疫逃逸等方面具有重要作用。

除了N蛋白外，PEDV的核酸核糖內切酶(endoribonuclease ，EndoU)在逃避宿主巨噬細胞先天免疫中可能發(fā)揮關鍵作用。用構建的PEDV EndoU缺陷病毒株感染PK1細胞和巨噬細胞發(fā)現，缺陷型PEDV感染PK1細胞和巨噬細胞的IFN水平均高于野生型，由于PK細胞主要分泌Ⅲ型IFN，巨噬細胞主要分泌Ⅰ型IFN，由此推斷EndoU能夠減輕機體的Ⅰ型和Ⅲ型IFN的應答，從而逃避宿主的先天免疫防御[30-31]。除PEDV外，其他冠狀病毒，如嚴重急性呼吸綜合癥病毒(SARS-CoV)也表達EndoU，說明EndoU在研究冠狀病毒的免疫逃逸及設計新型減毒活疫苗方面有重要意義[32]。

5 豬α冠狀病毒檢測新技術研究

對于豬冠狀病毒的檢測方法，目前研究十分廣泛，如RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光RT-PCR方法、環(huán)介導等溫擴增以及適用于大批量樣品檢測的雙抗夾心ELISA方法等[33-34]，以上方法是利用引物來擴增病毒核酸或通過外源表達病毒蛋白來檢測相應病毒抗體的傳統(tǒng)方法。除常用方法外，生物芯片、實時動態(tài)細胞成像等新型技術也不斷被用于豬冠狀病毒的檢測，顯著提高了檢出效率。

5.1 蛋白質芯片技術

蛋白質芯片技術是以NC膜作為載體，結合可視化顯色技術的可視化蛋白芯片。蛋白質芯片技術是對常規(guī)ELISA方法的擴展，因為N蛋白在豬α冠狀病毒免疫逃逸方面的重要作用，通常采用外源表達方式獲取N蛋白作為檢測用的抗原蛋白，來檢測待測血清中的相應抗體，其優(yōu)點在于成品芯片在操作方面的便利。然而，以抗原抗體特異性反應為基礎的檢測手段受個體差異及免疫逃逸等因素的影響，在檢測準確率方面尚不及高通量成像技術。除N蛋白外，其他蛋白在豬冠狀病毒檢測中也有應用，通過外源表達S、M、N、E蛋白來檢測PEDV抗體發(fā)現，表達的S、M、N蛋白均能與抗體發(fā)生反應，而抗體的應答強度取決于抗原含量，S蛋白構成了病毒表面的日冕狀突起，M蛋白是病毒體膜中的主要蛋白，N蛋白是病毒感染過程中的主要蛋白，而E蛋白僅少量存在于病毒包膜中，以蛋白作為抗原進行免疫反應檢測的強度與該蛋白在病毒中的含量情況相吻合，即含量越高，反應越靈敏。N蛋白的N端存在PEDV、TGEV等冠狀病毒相同的抗原表位[35]，以N蛋白作為檢測抗原可能會出現交叉反應，在豬冠狀病毒的免疫學檢測中，S、M蛋白具有更大的價值，這一方面尚待深入研究。

5.2 高通量實時動態(tài)細胞成像及功能分析技術

高通量實時動態(tài)細胞成像及功能分析技術與高通量細胞成像分析系統(tǒng)，被用于豬冠狀病毒的檢測。該方法是將熱滅活的待測血清樣本在MEM培養(yǎng)基中用含有蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶進行稀釋，而后將血清樣本與PEDV等比例混合并孵育，再將混合物添加到含有Vero細胞的96孔板中進行孵育后與異硫氰酸熒光素標記的單克隆抗體進行反應，然后在高通量成像細胞儀上以541 nm讀取數據，通過與陰性對照對比，來判定是否為豬冠狀病毒感染[36]。該方法利用檢測中和抗體的細胞成像技術，具有可視化和計量細胞的優(yōu)點。在檢測過程中，使用高通量成像細胞儀進行讀取并評估結果，客觀的數據讀取方案和計算方法消除了人為操作的主觀性，且讀取時間不超過4 min。細胞成像術提供了一種客觀且快速的檢測方法。

6 展望

豬流行性腹瀉于20世紀70年代被發(fā)現，是由豬α冠狀病毒引起的傳染病，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害，其感染相關受體和免疫逃逸機制的研究為相關疫苗和檢測技術的研發(fā)提供了重要依據。近年來，對于病毒功能性受體的研究已成為病毒相關研究的重要內容。隨著相關研究的不斷深入，相信不久的將來由冠狀病毒引起的疾病一定會得到有效控制。