蔣彩云,劉家勛,吳 婷,葛偉麗,楊愛萍,王 新,吉志林,王玉萍

(1.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院,江蘇省食品安全工程技術(shù)研發(fā)中心,江蘇 南京 210007)(2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210097)

氯霉素類抗生素屬抑菌性廣譜抗生素,廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的治療[1-2]. 由于其對(duì)人體的毒性較大,能夠抑制骨髓造血功能,引起包括白細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、血小板減少等在內(nèi)的再生障礙性貧血,因此為了防止殘留氯霉素通過食物鏈進(jìn)入人體,該藥已被禁用于動(dòng)物性食品和水產(chǎn)品中[3-5].

目前,對(duì)于氯霉素殘留的檢測(cè)方法主要采用液相色譜法[6-9],該方法準(zhǔn)確度高,但樣品前處理過程較復(fù)雜,而分子印跡技術(shù)[10-14]是近幾年發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù),其技術(shù)原理為模板分子與功能單體特異性相結(jié)合形成印跡空穴,制備的印跡聚合物可用于選擇性識(shí)別模板分子[15-17],并能夠避免雜質(zhì)物干擾. 因而分子印跡技術(shù)可應(yīng)用于生物樣品中殘留抗生素檢測(cè)的前處理過程,進(jìn)一步提高抗生素的液相色譜檢測(cè)效率.

本文以氯霉素為研究對(duì)象,采用熱聚合法,以N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)為功能單體,成功制備出一種對(duì)氯霉素類抗生素具有選擇性吸附效果的印跡聚合物(MIPs). 采用FE-SEM、FT-IR、TG、BET表征手段對(duì)其形貌、表面官能團(tuán)、孔徑及比表面積等方面進(jìn)行表征. 實(shí)驗(yàn)考察了溫度、pH、初始濃度、平衡時(shí)間等因素對(duì)MIPs吸附量的影響,并確定了等溫吸附模型和吸附動(dòng)力學(xué)方程. 此外,還探究了該印跡聚合物對(duì)氯霉素的選擇性吸附效果.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

N-異丙基丙烯酰胺(阿拉丁試劑有限公司,NIPAM);氯霉素(阿拉丁試劑有限公司,CAP),甲砜霉素(阿拉丁試劑有限公司,TAP),氟甲砜霉素(上海麥克林生化科技有限公司,FLR),氧氟沙星(阿拉丁試劑有限公司,OFL),四環(huán)素(阿拉丁試劑有限公司,CTY),乙二醇二甲基丙烯酸酯(阿拉丁試劑有限公司,EGDMA),偶氮二異丁腈(阿拉丁試劑有限公司,AIBN),四氫呋喃(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,THF),甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),純水(SAGA-10TY純水儀,南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SHZ-88A型恒溫水浴振蕩器(太倉(cāng)市儀器設(shè)備廠),DF-101SA-H恒溫水浴鍋(南京晚晴化玻儀器有限公司),LG16-B型離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司),TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司),Pyris 1熱重分析儀(美國(guó)PERKIN-ELMR),HITACHI S4800高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM 日本JEOL公司),Cary 5000傅里葉變換紅外光譜(美國(guó)Agilent公司),ASAP2020比表面積測(cè)定儀(Micromeritics公司)

1.3 MIPs的制備

準(zhǔn)確稱取功能單體N-異丙基丙烯酰胺0.2 g與模板分子氯霉素0.1 g于離心管中預(yù)聚合,使用移液槍吸取溶劑四氫呋喃(THF)670 μL與上述離心管中,將所得溶液置于超聲波清洗器中超聲分散,直至模板分子與溫敏單體完全溶解,并且溶液呈清澈透明狀時(shí)取出,然后在上述分散液中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯500 μL,使其易交聯(lián)聚合,然后在上述混合溶液中加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈0.05 g,并置于超聲波清洗器中超聲溶解,最后將含有混合溶液的離心管用保鮮膜包裹,置于60 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h,即得到氯霉素印跡聚合物. 按照上述方法,不加CAP,制備非印跡聚合物(NIPs).

1.4 模板分子的去除

將上述所得產(chǎn)物研磨成粉末,采用體積比甲醇∶乙酸=9∶1溶液作為脫附溶劑,將MIPs用過濾紙雙層包裹放置于索式提取裝置中,再將索式提取裝置的燒瓶部分置于油浴鍋中,油浴溫度為100 ℃,油浴脫附液若干小時(shí),每隔固定時(shí)間更換脫附液,利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定脫附液中CAP的濃度,直至回流出的脫附液在紫外可見分光光度計(jì)275 nm處檢測(cè)不出氯霉素為止. 同時(shí),將NIPs亦用體積比甲醇∶乙酸=9∶1溶液浸泡4 h以出去未反應(yīng)單體. 最后用純水洗滌NIPs與脫附完全的MIPs,除去有機(jī)溶劑并烘干留有備用.

1.5 材料表征

將制備得到的MIPs與NIPs采用高分辨率場(chǎng)發(fā)射電子掃描顯微鏡(FT-SEM)對(duì)其表面形貌進(jìn)行表征,將粉末樣品微量并均勻的平鋪于具有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上,然后對(duì)樣品臺(tái)各個(gè)表面進(jìn)行噴金制樣,工作電壓為15 kV,工作距離為7.5 mm. 利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,以溴化鉀為背景,將溴化鉀與樣品按照一定比例(一般為30～100∶1)混合研磨壓片制樣,掃描范圍400～4 000 cm-1. 熱重分析(TG)的測(cè)試條件為氮?dú)夥諊?升溫速率10 ℃/min,溫度范圍為25～800 ℃. Brunauer-Emmett-Teller比表面積測(cè)定(BET)測(cè)試條件為氮?dú)夥諊?活化溫度為25～250 ℃.

1.6 吸附實(shí)驗(yàn)

1.6.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn),考察溫度、溶液初始pH值、反應(yīng)時(shí)間、CAP初始濃度等參數(shù)對(duì)吸附性能的影響.

MIPs與NIPs在25 ℃下的等溫吸附實(shí)驗(yàn)如下:準(zhǔn)確稱取20 mg MIPs與NIPs分別加入到體積均為 10 mL,濃度為30 mg/L到900 mg/L范圍的CAP溶液中,置于恒溫水浴振蕩器中吸附12 h后,離心收集上清液,最后利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定上清液中CAP的濃度,最大吸收波長(zhǎng)在275 nm處.

MIPs與NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)如下:準(zhǔn)確稱取20 mg MIPs與NIPs分別加入到體積為10 mL,初始濃度為30 mg/L的CAP溶液中,然后分別在吸附20 min、40 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min后,離心收集上清液,利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定上清液中CAP的濃度. MIPs與NIPs在時(shí)間t或平衡時(shí)的吸附量通過式(1)和(2)進(jìn)行計(jì)算

(1)

(2)

式中,Qt(mg/g)和Qe(mg/g)分別是CAP 的t時(shí)刻吸附容量和平衡吸附量,C0(mg/L)和Ct(mg/L)分別是CAP 的初始濃度和時(shí)間t時(shí)的濃度,V(L)是溶液體積,M(mg)是吸附劑的質(zhì)量.

1.6.2 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

為了考察MIPs 和NIPs對(duì)CAP的特異識(shí)別性能,選擇CAP的結(jié)構(gòu)性類似物甲砜霉素、氟甲砜霉素和結(jié)構(gòu)非類似物氧氟沙星、四環(huán)素進(jìn)行單組分選擇性吸附試驗(yàn). 分別配制濃度為30 mg/L的CAP和以上 4種抗生素的溶液,向其中分別加入20 mg MIPs與NIPs,置于恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)12 h,離心收集上清液,用紫外分光光度計(jì)分別在275 nm、224 nm、225 nm、294 nm、357 nm處分別測(cè)定上清液中CAP、TAP、FLR、OFL、TCY的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 FE-SEM譜圖分析

MIPs 和NIPs的形貌表征如圖1所示,采用熱聚合法制備出的MIPs和NIPs具有不同的形貌特征. NIPs的形貌是由尺寸在50～100 nm之間的小顆粒堆積形成的塊狀,并最終呈現(xiàn)出多層分布的鏤空狀;MIPs亦是由尺寸在50～100 nm之間的小顆粒堆積而成的塊狀,但不同的是,MIPs最終呈現(xiàn)的形態(tài)是塊狀表面散落的分布著不規(guī)則的小顆粒. 這可能是由于MIPs在制備過程由于交聯(lián)劑的作用將模板分子與功能單體交聯(lián)成結(jié)導(dǎo)致的,而NIPs由于在制備過程中沒有加入模板分子,使其表面沒有形成散落的顆粒.

2.2 FT-IR譜圖分析

本文借助于功能單體NIPAM分子與模板分子CAP的氫鍵相互作用,從而使得合成的印跡聚合物具備氯霉素的空穴位點(diǎn),進(jìn)而利于印跡聚合物在后續(xù)吸附實(shí)驗(yàn)中能夠與CAP特異性結(jié)合. 圖2為MIPs 和NIPs的FT-IR光譜分析結(jié)果,如圖所示,MIPs和NIPs在1 645 cm-1、1 560 cm-1、792 cm-1處均具有較強(qiáng)的NIPAM酰胺I帶和酰胺II帶的特征吸收峰[18-19];在1 155 cm-1、960 cm-1處均存在醇類羥基彎曲振動(dòng)和C—O的伸縮振動(dòng)峰,即為EGDMA的特征峰. 所不同的是,MIPs在2 974 cm-1和1 728 cm-1處存在烷烴類C—H基團(tuán)的收縮振動(dòng)峰和酮類羰基基團(tuán)的收縮振動(dòng)峰,且特征峰強(qiáng)度較NIPs明顯增強(qiáng). 這可能是由于MIPs聚合物中氯霉素的存在而導(dǎo)致紅外譜圖中存在特征峰強(qiáng)度的差異[20]. 綜上結(jié)果表明,模板分子氯霉素在MIPs的制備過程中被成功聚合.

2.3 TG譜圖分析

MIPs 和NIPs的熱重圖譜分析結(jié)果如圖3所示,由圖可知MIPs和NIPs均有兩個(gè)重量損失階段:(1)室溫～300 ℃,MIPs和NIPs材料中結(jié)晶水的損失;(2)300 ℃～500 ℃,骨架結(jié)構(gòu)的分解. 不同的是,NIPs在500 ℃時(shí)達(dá)到完全失重,而MIPs在800 ℃時(shí)仍然剩余8.5%的重量,這是由于MIPs在制備過程中加入了氯霉素,并且氯霉素與功能單體和交聯(lián)劑形成了一種不易熱分解的物質(zhì)[21]. 由此表明,加入模板分子制備而成的MIPs具有更高的熱穩(wěn)定性,并且進(jìn)一步證明模板分子被成功聚合.

圖2 MIPs 與NIPs的FT-IR表征Fig.2 FT-IR spectra of MIPs and NIPs

圖3 MIPs 與NIPs的TG表征Fig.3 TG curves of MIPs and NIPs

2.4 BET譜圖分析

MIPs與NIPs的氮?dú)馕?脫附曲線以及孔徑分布圖如圖4所示,從圖4可以看出,MIPs和NIPs的吸附-脫附等溫線在0～1.0的相對(duì)壓力范圍內(nèi)屬于典型的IV型等溫線,而曲線中的滯后環(huán)表明MIPs和NIPs存在介孔結(jié)構(gòu). MIPs的吸附-脫附等溫線在低壓(P/P0<0.8)階段,氮?dú)庠贛IPs內(nèi)表面主要以單層吸附的方式附著,隨著P/P0的逐漸升高,MIPs的吸附量隨之增大. 根據(jù)氮?dú)馕?脫附曲線的最大吸附量可以看出MIPs具有較好的吸附容量. 根據(jù)孔徑分布曲線可以看出,MIPs主要以介孔存在,并且孔徑分布不均勻. MIPs與NIPs的比表面積分別為105.7 m2/g和32.13 m2/g,孔容分別為0.402 5 cm2/g和0.158 3 cm2/g. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MIPs的比表面積是NIPs的3倍,出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是由于經(jīng)過脫附后的MIPs聚合物,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成了較NIPs內(nèi)部結(jié)構(gòu)中沒有的印跡空穴.

圖4 MIPs(A)與NIPs(B)的吸附脫附等溫曲線以及孔徑分布圖Fig.4 N2 and sorption-desorption isotherms and pore size distributions of MIPs and Nips

表1 MIPs 與NIPs的BET表征參數(shù)Table 1 BET data of MIPs and NIPs

2.5 溶液初始pH對(duì)吸附影響

實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素在材料吸附方面具有一定的影響. 本文首先考察了溶液初始pH的變化對(duì)CAP在MIPs與NIPs上吸附量的影響. 已報(bào)道的研究表明,氯霉素宜保存于pH條件為酸性或中性環(huán)境中,而在堿性環(huán)境中易水解失效. 因此,本文實(shí)驗(yàn)選取了溶液初始pH=2～8之間的實(shí)驗(yàn)條件(初始濃度為30 mg/L),考察CAP在MIPs 與NIPs上的吸附量的變化. 由圖5可以看出,隨著溶液初始pH的增大,CAP在MIPs 和NIPs上的吸附量呈先減少后增大最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì). 其中,當(dāng)溶液初始pH=2時(shí),CAP在MIPs上的吸附量為最大,Qe為8.39 mg/g,當(dāng)溶液初始pH=4時(shí),CAP在MIPs與NIPs上的吸附量均為最低,Qe分別為7.09 mg/g和4.29 mg/g. 這是由于當(dāng)溶液初始pH=4時(shí),MIPs與NIPs材料表面正電荷較多,而CAP的PKa=9.61,此時(shí)CAP溶液亦是正電荷偏多,由于同種電荷相互排斥作用,從而導(dǎo)致在溶液初始pH=4時(shí),CAP在MIPs與NIPs上的吸附量均減少的原因. 由于在實(shí)際水體中pH為中性,所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選擇溶液pH=7條件進(jìn)行探究.

2.6 溫度對(duì)吸附的影響

為考察溫度因素對(duì)CAP在MIPs與NIPs上吸附的影響,實(shí)驗(yàn)研究了MIPs 與NIPs在25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃條件下(初始濃度為30 mg/L),MIPs 與NIPs對(duì)CAP的吸附量的變化. 由圖6可知,隨著溫度的升高,MIPs 和NIPs對(duì)CAP的吸附量沒有明顯的變化. 這可能一方面是由于該制備方法采用的是熱聚合法,制備的聚合物本身處于比較穩(wěn)定狀態(tài),不易受環(huán)境溫度干擾. 另一方面是由于聚合體系使用的溶劑為極性較強(qiáng)的四氫呋喃,導(dǎo)致制備出的聚合物為堅(jiān)硬塊狀,使得NIPAM的溫度響應(yīng)性能沒有完全表現(xiàn)出來(lái).

圖6 溫度對(duì)MIPs 與NIPs吸附的影響Fig.6 Effect of temperature on adsorption

圖5 溶液初始pH對(duì)吸附的影響Fig.5 Effect of pH on adsorption

2.7 吸附等溫線

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了25 ℃下在MIPs 和NIPs 上的吸附等溫線. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示. CAP在MIPs與NIPs上的平衡吸附容量隨著初始濃度的增加而增加. 實(shí)驗(yàn)測(cè)定CAP在MIPs上的理論最大吸附容量為127.8 mg/g,而在NIPs上的理論最大吸附容量為112.9 mg/g.

(3)

(4)

Langmuir方程(3)可以用來(lái)描述單層吸附,而Freundlich方程(4)可以用來(lái)描述多層吸附[22-23]. 其中Qe是平衡吸附容量(mg/g),Ce是CAP的平衡濃度,Qm是最大吸附容量,KL是朗繆爾常數(shù)(mL/g),n和KF是弗氏常數(shù). 圖7為擬合曲線,表2列出了擬合參數(shù)Qm、KL、KF、n和R2(相關(guān)系數(shù)),發(fā)現(xiàn)MIPs與NIPs對(duì)于Langmuir方程來(lái)說(shuō),R2均大于0.97,由此說(shuō)明Langmuir方程能更好地?cái)M合等溫線數(shù)據(jù),即MIPs與NIPs吸附過程為單分子層吸附.

表2 MIPs與NIPs等溫模型擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of isothermal adsorption

2.8 吸附動(dòng)力學(xué)

由MIPs和NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可知,CAP的吸附容量隨吸附時(shí)間的增加而增加,動(dòng)力學(xué)吸附量在2 h達(dá)到吸附平衡(圖8). 利用準(zhǔn)一級(jí)方程(5)和準(zhǔn)二級(jí)方程(6)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析[24-25],確定了反應(yīng)速率控制和傳質(zhì)機(jī)理. 模型參數(shù)擬合結(jié)果和R2值見表3,結(jié)果表明,兩種動(dòng)力學(xué)模型對(duì)于MIPs的吸附過程均具有較高的擬合相關(guān)系數(shù)(R2>0.98). 這是由于MIPs具備的立體空腔和結(jié)合位點(diǎn)上的特定分子識(shí)別作用,以及隨機(jī)分布在表面上的官能團(tuán)的共同吸附所致,即該吸附過程既有物理吸附,也有化學(xué)吸附. 然而,準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)于NIPs的動(dòng)力學(xué)吸附過程有更高的擬合相關(guān)系數(shù)(R2=0.997),這表明化學(xué)相互作用在此吸附過程起主要作用. 由此進(jìn)一步說(shuō)明MIPs的功能單體與模板分子的印跡作用.

logQe-Qt=logQe-K1t,

(5)

(6)

式中,K1(min-1)是準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù),K2(g/(mg/min))是準(zhǔn)二級(jí)速率常數(shù).

表3 MIPs與NIPs吸附動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of adsorption kinetics

圖8 MIPs與NIPs吸附動(dòng)力學(xué)模型Fig.8 Adsorption kinetic model of MIPs and NIPs

圖9 MIPs與NIPs對(duì)各個(gè)抗生素的吸附效果Fig.9 Adsorption effects of MIPs and NIPs on antibiotic

2.9 MIPs與NIPs對(duì)各個(gè)抗生素的吸附效果

選擇性吸附效果是評(píng)價(jià)分子印跡聚合物材料性質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo). 本文選用了兩種氯霉素同類別抗生素FLR和TAP,以及另外兩種氯霉素非同類別抗生素OFL和CTY,評(píng)價(jià)MIPs和NIPs材料對(duì)各個(gè)抗生素的吸附效果. 由圖9可知,MIPs對(duì)OFL和CTY的吸附量分別為2.149和2.152 mg/g,以及對(duì)TAP、 FLR、CAP的吸附量分別為4.203、6.702和7.722 mg/g. 結(jié)果表明,MIPs對(duì)氯霉素類抗生素的吸附比起非同類別抗生素具有明顯優(yōu)勢(shì). 由于OFL和CTY 在結(jié)構(gòu)上與CAP的結(jié)構(gòu)差異較大,而FLR和TAP分子結(jié)構(gòu)與CAP結(jié)構(gòu)相似,并且MIPs在制備過程中形成了CAP印跡空穴位點(diǎn),從而對(duì)氯霉素類抗生素具有明顯的選擇性吸附效果. 其吸附效果順序?yàn)镃AP>FLR>TAP>TCY>OFL. 結(jié)果說(shuō)明制備的MIPs對(duì)氯霉素具有選擇性吸附性能.

3 結(jié)論

本文以氯霉素為模板分子,異丙基丙烯酰胺為功能單體,采用熱聚合法,制備出了一種對(duì)氯霉素類抗生素具有較大的吸附量和較好選擇性的印跡聚合物. 通過FT-IR和TG的結(jié)果表明,MIPs的模板分子在制備過程中被成功印跡. 氮?dú)馕?脫附曲線結(jié)果顯示,MIPs為介孔吸附劑,并具有較大的比表面積,為吸附效果良好提供佐證. 通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MIPs在室溫下,pH=7條件下,吸附2 h達(dá)到吸附平衡,理論最大吸附量為127.8 mg/g,并且該吸附過程更符合Langmuir單分子層等溫吸附模型以及準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程. 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MIPs對(duì)氯霉素類抗生素具有較好的選擇性.