鄭鑫飛，阮俊豪，陳翔藝，張淑芳，葉愛華，王詩(shī)穎，劉榮強(qiáng)

福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院放療科，福建南平 353000

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球?qū)m頸癌患病人數(shù)為57萬，病死人數(shù)為31.1萬，其中約84%的宮頸癌患者來自發(fā)展中國(guó)家[1]。隨著人們生活水平的提高和惡性腫瘤防治理念的逐漸普及，宮頸癌的預(yù)防與控制工作初見成效，但仍有較高的發(fā)病率[2]。因此，開發(fā)比婦科內(nèi)鏡檢查、高危型人乳頭瘤病毒及宮頸癌液基細(xì)胞檢測(cè)更加有效的早期篩查方法顯得尤為重要。目前，宮頸癌治療手段主要包括手術(shù)、化療及放療，早期宮頸癌患者經(jīng)過系統(tǒng)治療后生存率明顯提高，但是對(duì)于復(fù)發(fā)或新發(fā)轉(zhuǎn)移性病灶患者治療手段仍然十分有限。腫瘤基因?qū)W是腫瘤研究的基礎(chǔ)，對(duì)腫瘤的生物學(xué)特征及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，將有助于在未來開發(fā)出更有效的診斷及治療方法[3]。CXC趨化因子配體8(CXCL8)是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中CXCL8通過自分泌或旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)揮免疫抑制作用[5]。CXCL8作為一種重要的多功能趨化細(xì)胞因子，與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后相關(guān)，故本研究擬探討CXCL8水平與宮頸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床宮頸癌診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1數(shù)據(jù)庫(kù)研究對(duì)象 選取TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來源的306份宮頸癌組織和13份正常宮頸組織標(biāo)本，以及有總生存期(OS)資料的宮頸癌患者292例為在線數(shù)據(jù)分析研究對(duì)象。

1.1.2臨床研究對(duì)象 選取2012年7月至2019年2月本院收治的76例宮頸癌患者，所有患者的宮頸癌組織及癌旁組織標(biāo)本均經(jīng)病理活檢或手術(shù)采集。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)；癌旁組織為距腫瘤病灶5 cm以上的組織，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證實(shí)；所有患者均為初診，且參與本研究前未行放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡>80歲；合并其他較為嚴(yán)重的婦科疾?。缓喜⑵渌愋蛺盒阅[瘤；合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；合并認(rèn)知障礙及精神疾??；無完整的臨床及隨訪資料。76例宮頸癌患者年齡21～80歲，平均(49.69±13.54)歲；宮頸癌TNM分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期17例，Ⅲ期 7 例,Ⅳ期13例；分化程度：低分化52例，中、高分化24例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的25例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的51例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的29 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的47例；有淋巴脈管浸潤(rùn)的47例，無淋巴脈管浸潤(rùn)的29例；浸潤(rùn)深度：T1+T2有62例，T3+T4有14例。所有患者的治療均參照《2019 NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南(第1版)》，即Ⅰ～ⅡA期采用手術(shù)或放療，手術(shù)方式為根治性子宮切除術(shù)、盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)和(或)腹主動(dòng)脈淋巴結(jié)取樣術(shù)，且當(dāng)術(shù)后有復(fù)發(fā)高危因素(子宮旁、深間質(zhì)浸潤(rùn)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)時(shí)需輔助同步放、化療；ⅡB～ⅣA期采用同步放化療；ⅣB期以系統(tǒng)支持治療為主。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1在線數(shù)據(jù)分析 采用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(GEPIA)網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來源的306份宮頸癌組織和13份正常宮頸組織標(biāo)本中的CXCL8表達(dá)水平。進(jìn)入Survival頁面繪制生存曲線圖，預(yù)后指標(biāo)為OS，將TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來源的有OS資料的宮頸癌患者292例以CXCL8中位水平為界分為CXCL8低表達(dá)和CXCL8高表達(dá)患者，比較CXCL8高、低表達(dá)患者的預(yù)后情況。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)組織CXCL8表達(dá)水平 本院宮頸癌患者術(shù)后均留取新鮮組織標(biāo)本于-80 ℃凍存。檢測(cè)時(shí)將冰凍標(biāo)本取出，解凍后打成勻漿，按照Trizol試劑盒說明書(美國(guó)Invitrogen公司)加入1 mL Trizol試劑，振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度。總RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，CXCL8引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的序列，采用Oligo Architect在線引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CXCL8上游引物序列：5′-CTTTGTCCATTCCCACTTCTGA-3′，下游引物序列：5′-TCCCTAACGGTTGCCTTTGTAT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，95 ℃變性15 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。通過 2-ΔΔCt法計(jì)算CXCL8的表達(dá)水平。

1.3隨訪 采用電話和門診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止2020年2月或患者死亡。OS的定義為從腫瘤確診至隨訪截止或死亡的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1在線分析宮頸癌組織CXCL8表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系 采用GEPIA網(wǎng)站分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來源的宮頸癌組織中CXCL8的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中CXCL8表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見圖1。采用GEPIA網(wǎng)站分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來源的宮頸癌患者的預(yù)后，生存曲線分析結(jié)果顯示，CXCL8低表達(dá)患者總生存率明顯高于CXCL8高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見圖2。

注：*P<0.001。

圖2 數(shù)據(jù)庫(kù)來源的宮頸癌CXCL8高、低表達(dá)患者的生存曲線

2.2宮頸癌組織與癌旁組織CXCL8表達(dá)水平比較 本院76例患者宮頸癌組織的CXCL8表達(dá)水平(1.575±0.421)高于癌旁組織(0.705±0.272)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。

2.3CXCL8表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 將本院76例患者的宮頸癌組織以CXCL8水平的均值(1.575)為界分為CXCL8低表達(dá)30例和CXCL8高表達(dá)46例，分析CXCL8表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，CXCL8表達(dá)水平與患者年齡、宮頸癌TNM分期、分化程度有關(guān)(P<0.05)，與宮頸癌淋巴脈管浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05) ，見表1。

表1 CXCL8表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.4CXCL8表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系 對(duì)本院76例宮頸癌患者隨訪12～84個(gè)月，中位OS為25.80個(gè)月，其中CXCL8高表達(dá)患者的中位OS為23.65個(gè)月，低于CXCL8低表達(dá)患者的30.48個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),生存曲線見圖3。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，CXCL8表達(dá)水平、TNM分期與浸潤(rùn)深度是宮頸癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，CXCL8表達(dá)水平是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表2。

圖3 宮頸癌CXCL8高、低表達(dá)患者的生存曲線

表2 宮頸癌患者預(yù)后的影響因素分析

3 討 論

宮頸癌是女性腫瘤相關(guān)死亡的常見原因之一。在我國(guó)，宮頸癌每年新發(fā)病例數(shù)約13.15 萬,占全球?qū)m頸癌新發(fā)病例數(shù)的28.8%[3]。高危型人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌的主要病因，而免疫抑制狀態(tài)，如感染人類免疫缺陷病毒或服用免疫抑制劑等可增加對(duì)其的易感性。晚期、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的宮頸癌患者治療效果較差，近年來免疫治療，特別是程序性死亡受體-1、程序性死亡配體-1抑制劑等免疫治療藥物的開發(fā)和應(yīng)用為晚期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者帶來了新的希望，但免疫治療并不是對(duì)所有宮頸癌患者都有效[7]。因此，找到更多參與宮頸癌發(fā)病機(jī)制的基因或蛋白，對(duì)開發(fā)新藥物、宮頸癌患者風(fēng)險(xiǎn)分層，以及實(shí)施個(gè)體化治療都至關(guān)重要。

CXCL8是一種屬于彈性蛋白樣重組體的CXC趨化因子。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等促炎細(xì)胞因子可快速誘導(dǎo)CXCL8的表達(dá)。有研究證實(shí)，CXCL8在食管癌、直腸癌、非霍奇金淋巴瘤組織中的表達(dá)水平較正常組織明顯升高[8-10]，且在乳腺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌患者中高表達(dá)的CXCL8與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[11-16]。本研究中，TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來源的宮頸癌組織中CXCL8表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織；本院76例患者宮頸癌組織的CXCL8表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示CXCL8表達(dá)水平升高與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CXCL8在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力降低及細(xì)胞凋亡[17-19]，提示CXCL8參與了腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。此外，CXCL8作為一種重要的多功能細(xì)胞因子，通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸激酶(AKT)、兩面神激酶(JAK)/非受體型酪氨酸蛋白激酶(STAT)等信號(hào)通路發(fā)揮致癌作用[14,20]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9的表達(dá)上調(diào)，從而協(xié)助腫瘤細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移過程中穿透機(jī)體天然組織屏障、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與局部浸潤(rùn)[21]。此外，CXCL8通過改變與凋亡和多藥耐藥相關(guān)的信號(hào)通路，直接影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，從而影響患者預(yù)后[22]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，使用CXCL8受體拮抗劑可以抑制腫瘤微環(huán)境中的血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲[23]。鑒于以上證據(jù)，開發(fā)CXCL8及其受體拮抗劑類藥物可能會(huì)為宮頸癌精準(zhǔn)治療帶來新的希望。

本研究通過分析數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)CXCL8表達(dá)水平在宮頸癌組織中明顯升高，且與預(yù)后有關(guān)。隨后使用本院76例宮頸癌組織及癌旁組織進(jìn)行了驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)在宮頸癌組織中CXCL8表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，CXCL8表達(dá)水平與年齡、TNM分期、分化程度有關(guān)，且CXCL8表達(dá)水平是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，上述結(jié)果均提示CXCL8在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，可作為判斷宮頸癌患者預(yù)后的指標(biāo)，為臨床個(gè)體化治療提供依據(jù)。