張相猛，徐秋芳，施怡茹，盧曉蕓，趙錦江，徐瑞芳

上海市青浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，上海 201700

由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球大范圍的暴發(fā)、流行[1]。人感染SARS-CoV-2后常出現(xiàn)乏力和呼吸道癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、氣促和呼吸困難等[2]。SARS-CoV-2傳染力強(qiáng)，易造成聚集性感染，其常規(guī)檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR[3]，主要針對(duì)SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白(N)基因進(jìn)行檢測(cè)[4]。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒，對(duì)紫外線和熱敏感，現(xiàn)在普遍認(rèn)為56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇等均可有效滅活SARS-CoV-2[5-6]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》[7]，感染性材料或活病毒應(yīng)在采用可靠的方法滅活后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸檢測(cè)，但是指南對(duì)具體滅活方法并沒有進(jìn)行明確規(guī)定。目前，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)假陰性率過高，滅活對(duì)病毒檢出率的影響不容忽視。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選取本院SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果為陽性的18份未滅活咽拭子標(biāo)本為研究對(duì)象。

1.2儀器與試劑 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)、干浴鍋(上海藍(lán)豹實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、全自動(dòng)核酸提取儀(江蘇碩世科技股份有限公司)、LightCycle 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒(雙重?zé)晒釶CR法，上海之江生物科技股份有限公司，批號(hào)：20200303)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理 將所有標(biāo)本均勻分成7份，每份體積為250 μL；分別采用56 ℃金屬浴30 min、56 ℃金屬浴60 min、56 ℃水浴30 min、56 ℃水浴60 min、化學(xué)裂解15 min、化學(xué)裂解30 min 6種方法進(jìn)行標(biāo)本前處理；每份標(biāo)本均設(shè)置對(duì)照(不做任何處理)。

1.3.2核酸檢測(cè) 采用全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。按照SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒說明書配制好核酸檢測(cè)體系，加樣后置于LightCycle 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀上，45 ℃、10 min，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，循環(huán)40次。在58 ℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，熒光通道選擇FAM、HEX/VIC/JOE和CY5通道，分別檢測(cè)ORF1ab基因、N基因和內(nèi)源性基因MNBH，內(nèi)源性基因?yàn)閰⒄栈?。此次?shí)驗(yàn)中各反應(yīng)孔內(nèi)源性基因Ct值均符合試劑盒說明書判定要求，因此其Ct值不在文中具體列出。

1.3.3結(jié)果判定 靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增曲線不呈S型，Ct值>39.00或Ct值空白為陰性；擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值≤39.00為陽性。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：需滿足以下2個(gè)條件中的任意1個(gè)，(1)同一份標(biāo)本中SARS-CoV-2 2個(gè)靶標(biāo)(ORF1ab、N基因)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性；如果出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性的檢測(cè)結(jié)果，則需重新采樣、重新檢測(cè)，如果仍為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性。(2)兩種類型標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測(cè)中均出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性的檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽性[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同標(biāo)本前處理方法下ORF1ab基因檢測(cè)結(jié)果 不進(jìn)行標(biāo)本前處理時(shí)ORF1ab基因檢出率為100.00%。經(jīng)56 ℃水浴30 min、56 ℃水浴60 min處理后，ORF1ab基因檢出率分別為94.44%、100.00%。經(jīng)56 ℃水浴30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為1.13(-0.37,2.55)，經(jīng)56 ℃水浴60 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為0.25(-1.81,0.79)。經(jīng)化學(xué)裂解15 min、化學(xué)裂解30 min處理后，ORF1ab基因檢出率分別為77.78%、50.00%。經(jīng)化學(xué)裂解15 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為2.94(2.43,4.17)，經(jīng)化學(xué)裂解30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為4.30(3.55,5.52)。經(jīng)56 ℃金屬浴30 min、56 ℃金屬浴60 min處理后，ORF1ab基因檢出率分別為83.33%、77.78%。經(jīng)56 ℃金屬浴30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為2.01(0.43,4.80)，經(jīng)56 ℃金屬浴60 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為1.75(-0.44,4.20)。不同標(biāo)本前處理方法與不處理檢測(cè)值的差值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=39.26，P<0.05)。見表1。

表1 不同標(biāo)本前處理方法下ORF1ab基因檢測(cè)結(jié)果

2.2不同標(biāo)本前處理方法下N基因檢測(cè)結(jié)果 不進(jìn)行標(biāo)本前處理時(shí)N基因檢出率為100.00%。經(jīng)56 ℃水浴30 min、56 ℃水浴60 min處理后，N基因檢出率均為100.00%。經(jīng)56 ℃水浴30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為0.80(-0.01,2.71)，經(jīng)56 ℃水浴60 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為0.39(-1.10,0.80)。經(jīng)化學(xué)裂解15 min、化學(xué)裂解30 min處理后，N基因檢出率分別為77.78%、61.11%。經(jīng)化學(xué)裂解15 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為2.63(0.83,3.36)，經(jīng)化學(xué)裂解30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為4.40(3.19，6.23)。經(jīng)56 ℃金屬浴30 min、56 ℃金屬浴60 min處理后，N基因檢出率分別為88.89%、77.78%。經(jīng)56 ℃金屬浴30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為2.09(-0.09,3.42)，經(jīng)56 ℃金屬浴60 min處理與不處理檢測(cè)值的差值為0.63(-1.83,6.59)。不同標(biāo)本前處理方法與不處理檢測(cè)值的差值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=27.32，P<0.05)。見表2。

表2 不同標(biāo)本前處理方法下N基因檢測(cè)結(jié)果

2.3不同標(biāo)本前處理方法下SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果 18份標(biāo)本不進(jìn)行標(biāo)本前處理時(shí)雙靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均為陽性。1份標(biāo)本經(jīng)56 ℃水浴30 min處理后出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，假陰性率為0.00%(0/18)；經(jīng)56 ℃水浴60 min處理后18份標(biāo)本雙靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均為陽性，假陰性率為0.00%(0/18)。經(jīng)化學(xué)裂解15 min處理后出現(xiàn)2份標(biāo)本雙靶標(biāo)陰性，3份標(biāo)本單靶標(biāo)陽性，假陰性率為11.11%(2/18)；經(jīng)化學(xué)裂解30 min處理后出現(xiàn)7份標(biāo)本雙靶標(biāo)陰性，2份標(biāo)本單靶標(biāo)陽性，假陰性率為38.89%(7/18)。經(jīng)56 ℃金屬浴30 min處理后出現(xiàn)1份標(biāo)本雙靶標(biāo)陰性，3份標(biāo)本單靶標(biāo)陽性，假陰性率均為5.56%(1/18)；經(jīng)56 ℃金屬浴60 min處理后出現(xiàn)1份標(biāo)本雙靶標(biāo)陰性，6份標(biāo)本單靶標(biāo)陽性，假陰性率為5.56%(1/18)。見表3。

表3 不同標(biāo)本前處理方法下SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果(ORF1ab基因/N基因)

3 討 論

由于SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)，因此在進(jìn)行標(biāo)本核酸提取前需進(jìn)行滅活處理，但是滅活過程可能會(huì)造成病毒核酸降解，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性[8]。

本研究中，ORF1ab與N基因經(jīng)56 ℃水浴30 min處理與不處理檢測(cè)值的差值,經(jīng)56 ℃水浴60 min處理與不處理檢測(cè)值的差值均較低，且假陰性率均為0.00%，說明經(jīng)56 ℃水浴處理后標(biāo)本檢測(cè)值最接近不處理時(shí)的檢測(cè)值，且對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果的判定影響最小。本研究中56 ℃水浴60 min對(duì)檢測(cè)值的影響小于56 ℃水浴30 min，考慮可能與以下因素有關(guān)：將大批量標(biāo)本放置于水浴鍋中加熱時(shí)，水浴時(shí)間太短會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本內(nèi)部溫度不均勻，可能會(huì)影響病毒核酸的提取和PCR擴(kuò)增[8],而延長水浴時(shí)間至60 min則可使標(biāo)本受熱更均勻，溫度更接近或達(dá)到56 ℃。但有研究使用56 ℃水浴30 min處理咽拭子標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)該處理方法對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果無明顯影響[9]，但是該研究所檢測(cè)的陽性標(biāo)本ORF1ab和N基因的Ct值為19～30，未能覆蓋病毒含量較低的標(biāo)本，而本研究中陽性標(biāo)本ORF1ab和N基因的Ct值為21.47～36.95，提示該結(jié)論同樣適用低病毒含量的標(biāo)本。本研究56 ℃金屬浴30 min、56 ℃金屬浴60 min、化學(xué)裂解15 min、化學(xué)裂解30 min這4種標(biāo)本前處理方法均出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。56 ℃金屬浴處理后標(biāo)本ORF1ab、N基因檢測(cè)值較不處理時(shí)有明顯變化，ORF1ab、N基因的檢出率也均低于不處理時(shí)的檢出率。該結(jié)果與華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科所得出的56 ℃金屬浴60 min滅活不影響呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果的結(jié)論不一致[10]。對(duì)于56 ℃金屬浴和56 ℃水浴處理后結(jié)果不同的現(xiàn)象，考慮可能與升溫介質(zhì)和升溫速度不同有關(guān)[9]，具體原因目前尚未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。而經(jīng)化學(xué)裂解處理后標(biāo)本檢測(cè)值較不處理時(shí)的檢測(cè)值有較大變化，且假陰性率高，其原因可能是標(biāo)本經(jīng)長時(shí)間裂解后，釋放的SARS-CoV-2核酸被RNA酶降解。

綜上所述，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的標(biāo)本前處理方法應(yīng)首選56 ℃水浴60 min和56 ℃水浴30 min，即使在病毒含量較低的標(biāo)本中，經(jīng)過該方法處理，病毒核酸依然能被檢出。而化學(xué)裂解法對(duì)標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果影響最大，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，不建議在日常實(shí)驗(yàn)中使用。為減少標(biāo)本前處理過程中可能導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)室感染，應(yīng)選擇水浴鍋這類穩(wěn)定的加熱裝置讓標(biāo)本均勻受熱，通過分散放置標(biāo)本或適當(dāng)延長加熱時(shí)間等措施使標(biāo)本溫度達(dá)到56 ℃，確保SARS-CoV-2滅活達(dá)到實(shí)驗(yàn)室安全要求。